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根结线虫对日光温室黄瓜生理生化特性的影响.pdf58页
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山东农业大学硕士学位论文
日光温室黄瓜根结线虫病是近年来越来越严重的一种病害，该病严重
影响黄瓜的产量和品质，而且防治比较困难。本试验以新泰密刺黄瓜为试
材，研究了南方根结线虫对黄瓜生长及生理生化的影响，为根结线虫病的
防治提供理论依据。试验结果如下：
1、日光温室黄瓜感染根结线虫后，黄瓜的株高、叶片干重、茎干重
明显下降：根系鲜重在生长前期增加缓慢，后期由于形成巨型细胞，鲜重
迅速上升；根系活力显著下降：黄瓜叶片叶绿素含量和光合速率降低，严
重影响了黄瓜的光合作用和干物质的积累，最终导致黄瓜减产。南方根结
线虫侵染使黄瓜果实中可溶性糖、可滴定酸含量升高；可溶性蛋白在线虫
密度低时升高，线
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RNA干扰在植物抗根结线虫病基因工程应用中的研究进展34
基因组学与应用生物学，2009年，第28卷，第1；专题介绍Review；RNA干扰在植物抗根结线虫病基因工程应用中的研究；牛俊海1郭仰东1简恒2*；1中国农业大学农学与生物技术学院蔬菜系,北京,1；摘要植物根结线虫病对农业生产的危害连年加重，以轮；生产的需要；致其出现寄生、发育、代谢、运动等障碍甚至致死，从；关键词；RNA干扰,双链RNA,根结线虫,基因工程
基因组学与应用生物学，2009年，第28卷，第1期，第167－１73页GenomicsandAppliedBiology,2009,Vol.28,No.1,167－１73专题介绍ReviewRNA干扰在植物抗根结线虫病基因工程应用中的研究进展牛俊海1郭仰东1简恒2*1中国农业大学农学与生物技术学院蔬菜系,北京,中国农业大学农学与生物技术学院植病系线虫学实验室,北京,100094*通讯作者,hengjian@摘要植物根结线虫病对农业生产的危害连年加重，以轮作和化学农药为主的传统防治难以满足现代农业生产的需要。以常规的抗性育种和表达外源蛋白为主的抗线虫转基因育种主要受限于抗性基因的匮乏。而近来RNA干扰技术的应用为抗线虫基因工程带来新的突破，通过构建RNA干扰载体，在转基因植物中表达寄并经口针取食被导入线虫体内，并引发线虫的系统性RNA干扰反应，导生线虫重要基因的dsRNA或siRNA，致其出现寄生、发育、代谢、运动等障碍甚至致死，从而使转基因植物实现对寄生线虫的抗性。本文综述了RNAi介导的抗根结线虫基因工程方面的研究进展，分析探讨了这种新的策略的特点并展望了它的应用前景。关键词RNA干扰,双链RNA,根结线虫,基因工程ProgressintheStudyofRNAiMediatedPlantRoot-knotNematodesResis-tantGeneticEngineeringNiuJunhai1GuoYangdong1JianHeng2*1DepartmentofVegetableScience,CollegeofAgricultureandBiotechnology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing,LaboratoryofNema-tology,DepartmentofPlantPathology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing,100094*Correspondingauthor,hengjian@AbstractAgriculturallossescausedbyplantroot-knotnematodesisincreasingcontinuely.Traditionalcontrolstrategiessuchascroprotationandnematicidalcannotmeettheneedsofmodernagriculturedevelopment.Resis-tancebreedingandgeneticengineeringmainlylimitedbythelackofresistancegene.Recentlyanemergingbreak-throughintransgenicresistancebreedingistheuseofRNAinterferencetechnology,transgenicplantsexpressingdsRNAhairpinstructurestargetingroot-knotnematodeessentialgenes.dsRNAorsiRNAswasoraluptakedbyes-tablishedplantparasiticnematodesthroughthefeedingtube,whichelicitasystemicRNAiresponseandthenin-duceahighlydetrimentalorlethalRNAiphenotypeinnematode.Sothetransgenicplantsobtaintheresistancetoroot-knotnematodes.ThispaperreviewstheprogressofRNAimediateddefenceagainstplantparasiticnema-todes,thecharacteristicsofthisnewstrategyandprospectofitsapplication.KeywordsRNAinterference,dsRNA,Root-knotnematode,Geneticengineering性的植物病原物”(Castagnone-Sereno,2006)。根结线虫隶属于线虫门(Nematoda)、侧尾腺口纲(Secernentea)、垫刃目(Trycenchida)、异皮总科(Hetenoderidea)、根结线虫属(Meloidodynidae)。目前世界上已报道九十多种，受其危害的植物有一千多种(刘维志,编著,2004,中国农业出版社,pp.1-4)。以番茄为主的蔬菜作物，由于保护地种植面积的扩严重者大，病害连年增加，发病地块减产20%以上，植物寄生线虫是一类寄主广泛、危害极大的病原，每年造成世界农业生产的损失大约1250亿美元(Chitwood,2003)，主要来自根结线虫(Meloidogynespp.)和孢囊线虫(HeteroderaandGloboderaspp.)为主的固着型内寄生线虫的危害，特别是根结线虫，因其适应性强，传播途径多样，寄主范围广泛，危害性极大。根结线虫中分布最广泛的种―南方根结线虫(Meloidogyneincognita)甚至被称作“世界上最具破坏基金项目：本研究由公益性行业专项(NYHYZX07－050)、农业部948项目(2006－G54)和国家十一五支撑项目(2006BAD08A08)资助168基因组学与应用生物学GenomicsandAppliedBiologywww.genoapplbiol.org甚至绝收(彭德良,1998)。结并不免疫(Hoetal.,1992;Milliganetal.,1998)，且抗性在32℃以上的高温下失活。一些蔬菜作物种如葫芦科甚至没有鉴定到抗性种质(Roberts,1992)。因此，传统的根结线虫防治策略已经难以满足农业生产的需要。随着分子生物学和植物基因工程的发展，近年来通过基因工程手段对植物进行遗传改良，有很多外源蛋白基因转入植物中，以实现抗性育种的目的。1植物根结线虫的危害方式根结线虫的二龄幼虫(J2)通过头部敏感的化感器(amphid)寻找寄主植物的根(Bird,2004)，以根尖组织为侵染部位，侵入后选择合适的细胞，以口针刺穿植物的细胞壁，将食道腺分泌物注入细胞，从而使植物细胞发生复杂的生理生化变化，细胞核分裂但细胞质不分裂，最终形成超过正常细胞约100倍以上大小的多核巨细胞，改造后的巨细胞成为线虫的营养来源。而寄生线虫接下来寄生在这些食源细胞周围进行生长和繁殖(GodelieveandCarmen,2002)。根结线虫对植物的危害主要有入侵根部和口针穿刺吸食造成的组织损伤，而且这些损伤为其它病原物提供了方便的入侵通道，使植物更容易感染其它病害；另一方面，食道腺的分泌物刺激寄主植物根细胞的增大，以致形成巨型细胞，使根部细胞分裂形成瘤肿和过度分枝等畸形，抑制根茎顶端分生组织植物受害后细胞的分裂等。由于上述各方面的影响，就表现各种病害症状：根部生长点被破坏而停止生长或卷曲，根上形成瘤肿或过度分枝，根部组织的坏死和腐烂等；植物地上部顶芽和花芽坏死，茎叶卷曲，地上部的生长受到影响，植株矮小，色泽失常和早衰，严重时整株枯死(Atkinson,1994)。3表达外源蛋白的转基因抗线虫研究进展目前植物抗线虫基因工程中利用的外源蛋白主要有以下几类：一类是植物自身防御体系中的抗病相关基因，如诱导植物获得系统性抗性(systemicac-几丁质酶quiredresistance,SAR)反应的化学诱导物、外源凝集素等；另一类是对线虫生长有或胶原蛋白、抑制作用或对线虫具有毒性的外源蛋白，如苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)毒素为主的细菌毒素(Lietal.,2007)以及蛋白酶抑制剂(Urwinetal.,1998)等；第三类为线虫分泌物特异抗体(Rossoetal.,1996)；还有一类是植物自身的抗线虫基因在不同寄主植物间的遗传转化，如Mi1.2(Atkinsonetal.,2003;陈国华等,2007)。以上4种基因工程手段都能不同程度地降低病原线虫对植物的危害，但也面临着一些问题。首先，转基因植物抗性的实现都依赖于蛋白间的相互作用，外源蛋白通过与线虫病原物的识别和相互作用，引发复杂的抗病反应信号传导过程，由于病原物在不利的寄生条件下存在着频繁的遗传变异(Castagnone-Sereno,2002;Neveuetal.,2003)，因此，病原靶蛋白细微的结构变异都会使外源蛋白失去识别和相互作用，最终导致抗性的丧失(Neveuetal.,2003;Soberónetal.,2007)。如Bt毒素由苏云金杆菌天然产生，被广泛用于控制害虫，毒素必须与害虫肠内害虫cadherin受体的的cadherin受体结合才有效力，突变产生了对Bt毒素的抵抗力(Soberónetal.,2007)；而南方根结线虫的一些小种也能成功寄生于含Mi1.2的番茄品种上。其次，植物中的抗线虫基因缺乏，番茄栽培种中由于遗传变异较少，没有筛选到有效的抗线虫基因。该基因是Mi1.2是目前唯一被广泛利用的抗性基因，从野生种秘鲁番茄(Lycopersiconperuvianum)中发现并被导入栽培番茄(L.esculentum)中，这种单一基因2传统的抗线虫策略目前防治根结线虫主要采用三种策略(Starretal.,一是轮作为主的栽培措施，如瓜类、番茄等易2002)：感病作物与葱、蒜等感病轻的蔬菜轮作，可以一定程度降低虫口密度，但在可耕地锐减及温室栽培的条件下，这类措施给农业生产安排带来很多不便，使生产者的收益受损。二是使用化学杀线剂，目前市场上有一些高效的化学农药，可以降低根结线虫对作物的危害，但多代后线虫很容易产生抗药性，同时也增加了农业生产成本，破坏了土壤微环境，由于不符合对可持续发展和无公害农产品的需求，化学农药的使用在世界范围内越来越受到限制。三是选育抗线虫品种，种植线虫品种是防治线虫危害的理想选择，但植物中抗性资源非常匮乏，番茄中目前被克隆并广泛应用的只有一个基因Mi1.2，该基因对南方根结线虫(M.incognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)和花生根结线虫(M.arenaria)有良好的抗性，但对北方根RNA干扰在植物抗根结线虫病基因工程应用中的研究进展ProgressintheStudyofRNAiMediatedPlantRoot-knotNematodesResistantGeneticEngineering169的利用，有着抗性丧失的风险；同时由于其抗性谱狭窄，会改变土壤中线虫的种群结构，一些不受限制的线第三，植物来源的抗性基因有着种属界限。由于一个抗性基因抗性的实现，可能同时依赖于上游识别信号蛋白和下游的信号转导激活因子(ParkerandColeman,1997)，缺少了这些相关的基因，单一抗病基因的转入并不能有效地激活抗病反应，如转入了Mi1.2的烟草和拟南芥植物都没有产生对相应根结线虫的抗性(WilliamsonandKumar,2006)，而转Mi1.2基因的茄子虽然获得了对根结线虫的抗性，却没有Mi1.2基因即便在栽培番茄对蚜虫的抗性(Gogginetal.,2005)；中，转入Mi1.2基因的不同品种之间，对根结线虫的抗性也有很大的差别(Jacquetetal.,2005)。最后，由于目前世界范围内对生物安全性的争议，和其它转在农业生产上推广也面临很大困难。因此，鉴于目前植物抗线虫基因工程中存在的问题，有必要开发新的可持续抗根结线虫策略。而RNAi现象被发现和阐释后，迅速成为一种基因功能研究的强有力工具，并作为一种手段，应用于基因工程改良植物中。RNAi应用于植物病原线虫基因功能和转基因抗线虫也成为近几年研究植物病原线虫的一个热点。(Tabaraetal.,1998)，喂食表达dsRNA的转基因细菌(Timmonsetal.,2001)以及显微注射法(Timmonsand而根结线虫在寄生前不进食，没有成熟的转基因系统，且因体型较小显微注射困难并造成创伤，使得同样的方法难以借鉴(Bakhetiaetal.,2005b)。Urwin等(2002)发现使用神经刺激剂章鱼胺可诱导孢囊线虫寄生前二龄幼虫进食，喂食半胱氨酸产生了特异性的RNA干扰，线虫蛋白酶dsRNA后，体内该基因的mRNA水平降低，处理后的线虫和对照比较性比发生了明显的改变。这一策略很快推广到其它植物病原线虫研究中。在根结线虫方面，Fanelli等(2005)将花生根结线虫卵粒浸泡于含几丁质合成酶dsRNA的溶液中，抑制了线虫的孵化；Bakhetia等(2005a)诱导南方根结线虫二龄幼虫进食(2006)在南方根结线虫中分别将剪切因子和整合酶敲除后，处理后线虫在植物根系上产生的根结明显Huang等(2006b)干扰减少，且雌虫的生殖能力降低；该南方根结线虫食道腺表达的寄生相关基因16D10，基因可以作为植物转录因子的配基，刺激根系生长形成巨细胞，干扰后的线虫侵染能力降低63%~90%；Shingles等(2007)利用RNAi敲除了南方根结线虫半胱氨酸蛋白酶后，降低了线虫侵染能力。这些实验均证实外源dsRNA经植物寄生线虫取食进入体内后，可以导致同源基因发生转录后基因沉默。虫如北方根结线虫大量繁殖，上升为新的主要病害。Fire,1998)等均可实现dsRNA向线虫体内的导入；Yadav等基因一样，转基因抗线虫作物由于表达了新的蛋白，过氧化物酶dsRNA，降低了其寄生能力；4RNAi在植物寄生线虫基因功能研究中的应用RNAi是近年发现的普遍存在于生物体内的一种转录后调控策略，最先在秀丽小杆线虫(C.elegans)中得到阐释：双链RNA(dsRNA)可以导致同源基因的mRNA降解，从而导致转录后基因沉默(Fireetal.,dsRNA诱导的基因沉默因其具有高效性、特异1998)。性、可传导性以及可遗传性优点(Winstonetal.,2002;Grishoketal.,2000)，已经广泛应用于C.elegans和其它生物基因功能研究中(SenandBlau,2006)。由于植物寄生线虫尚不能人工培养和创造突变体库，缺乏成熟的转基因方法，常规的正向遗传学研究方法受到限制(Bakhetiaetal.,2005a)。RNAi作为一种反向遗传学技术，为植物寄生线虫功能基因组研究提供了便利。但如何将人工合成的dsRNA导入植物寄生线虫中成了一个难题，在自由生活的秀丽小杆线虫研究中，将线虫浸泡于含dsRNA的溶液5RNAi在植物抗寄生线虫基因工程研究中的应用RNAi不仅作为一种反向遗传学工具用于不同生物的基因功能研究中，更被作为一种基因工程策如广泛略应用于植物遗传改良(Mansooretal.,2006)，应用于植物抗病毒和细菌等病原生物(KasschauandCarrington,1998;Waterhouseetal.,2001;Escobaretal.,2001)；后来发展到抗植物寄生线虫这类多细胞低等近年来，RNAi在植物抗捕食动物(Lilleyetal.,2007)；性昆虫害虫研究中也取得了成功，毛颖波等在转基因植物中表达棉铃虫参与棉毒素(棉酚)解毒的P450基因的双链RNA，棉铃虫食用了此种转基因植物后，干扰RNA就渗透入棉铃虫消化食物的中肠壁内，P450基因的表达显著降低，对棉酚的耐受性大大减弱，蚕食棉花的胃口骤减，生长缓慢，甚至死亡(Mao170基因组学与应用生物学GenomicsandAppliedBiologywww.genoapplbiol.orgetal.,2007)。孟山都公司的Baum等(2007)通过在转基因玉米上表达了根虫的V-ATPaseA亚基基因的dsRNA，提高了玉米对根虫的抗性。在RNAi技术抗植物病原线虫应用方面，早在提取了该基因siRNA，用于喂食转GFP基因的秀丽小杆线虫后发现，转基因的秀丽小杆线虫GFP转录水平降低，荧光淬灭，丧失了转基因表型，该研究在证实植物和线虫有着相同RNAi机制的同时，也首次提出了在植物中表达线虫基因dsRNA用与基因工程抗线虫的设想。2006年，Yadav等人构建了植物RNA干扰载体，在烟草上表达了南方根结线虫剪切因子和整合酶且寄生的雌虫产卵量减少。Huang等(2006a)在拟南芥由于该基因在根结线虫不同种间高度保守，使得转同达63%~90%不等，每克根上虫卵减少69%~93%，时通过Northern杂交证实转基因植物中表达了16D10基因的dsRNA，并被植物细胞内的RNAi系2007年，Fairbairn等人在烟草上表统加工成siRNA。达了爪哇根结线虫一个推定的转录因子MjTis11的dsRNA，虽然没有明显增强寄主植物的抗性，但引起了该基因转录本丰度的降低。这些研究证明，转基因植物中构建线虫基因的RNA干扰载体，能够表达寄经线虫口针取食被生线虫基因的dsRNA或siRNA，传送到体内，并引发线虫系统性的RNAi反应，当靶运动等障碍甚至致死，从而使转基因植物实现对寄生线虫的抗性。与常规的植物基因工程抗线虫策略相比，植物介导的RNA干扰抗病原线虫有以下六方面的优势。第一，抗线虫的高效性。如果转基因植物表达了侵染植物的线虫将产生由于特定基因敲除后导致的干扰表型，而如果在转基因植物中表达多个基因或表达一个家族成员的保守系列的dsRNA，可以一次敲除多个基因，从而进一步造成了寄生线虫的干扰缺陷，使植物获得更大程度的抗性(Geldhofetal.,2006;Dafny-Yelinetal.,2007;Schmidetal.,2002)。发育、代谢、运动等障碍甚至任何导致其出现寄生、致死表型的基因都可以作为潜在的抗线虫靶标，而这样的基因数量众多，如对植物寄生线虫近源种C.elegans进行高通量RNAi分析，鉴定出约1750个perlenetal.,2001;Kamathetal.,2003)，因此，可用通过比于抗线虫的靶标基因选择余地较大。同时，较基因组学的方法，参考C.elegans功能基因组学的研究结果，可以方便地筛选出植物寄生线虫的目标基因(Alkharoufetal.,2007)。第三，抗线虫兼顾广谱性与特异性。常用的抗性蛋白如Bt，抗性缺乏选择，在杀死害虫的同时也抑制了其它有益生物的生存，植物来源的抗病基因转基因植物表达根结线虫重要的保守基因dsRNA抗性(Huangetal.,2006a;Gaoetal.,2006)，而不对其第四，抗性稳定持久。RNAi介导的抗性依赖于同源序列间的配对，部分碱基的变化不会阻止RNA分子之间的结合(Escobaretal.,2001)，因此，病原线虫靶基因的突变也不能突破转基因植物的抗性。第五，无寄主植物种属的限制。转Mi基因的烟草和拟南芥都不能获得对根结线虫病的抗性，说明其抗性的实现可能依赖于物种特异的关联蛋白，而植物介导RNAi需要的转录和加工系统在不同生物间保守，因此，在不同感病植物上表达都能获得成功。第六，RNAi抗线虫作物易于在农业生产上推达外源蛋白的转基因作物进入生产领域面临重重困难，而RNAi植物表达的是dsRNA和siRNA而不是蛋白质。作为植物调节生长发育和保持遗传稳定性的重要机制，植物内源的dsRNA和siRNA大量存不在，因此表达了与植物自身无同源序列的dsRNA，2002年，Boutla等人从转GFP基因沉默的烟草中，基因经敲除后能够产生致死或不育的表型(Zip-接种线虫后根结数比对照明显减少，如Mi抗性谱不足，基因的dsRNA，对北方根结线虫缺乏抗性。而当上表达了根结线虫寄生相关基因16D10的dsRNA，时，转基因植物可以获得对不同种根结线虫的广谱基因拟南芥对4种根结线虫的抗性水平均明显提高，它有益生物产生毒害。基因为重要基因时，会导致其出现寄生、发育、代谢、广：由于目前世界范围内对转基因安全性的争议，表也更容易被接受。足够的dsRNA，由于RNAi高效降解靶序列的特点，会对寄主植物产生不良的影响，6展望由于植物病原线虫的近源物种C.elegans基因组计划已经完成，许多基因的功能已有深入研究(http://www.wormbase.org/)；同时，南方根结线虫和北方根结线虫基因组测序也于近期陆续完成(Abad第二，不受抗病基因资源缺乏的限制。理论上，etal.,2008;Oppermanetal.,2008)。迅速增长的序列RNA干扰在植物抗根结线虫病基因工程应用中的研究进展ProgressintheStudyofRNAiMediatedPlantRoot-knotNematodesResistantGeneticEngineering171信息为利用比较基因组学方法研究根结线虫基因功能、筛选抗线虫靶标基因提供了极大方便；另外，RNA干扰在植物抗病毒、细菌、线虫以及昆虫基因工程研究方面的成功，显示了该技术用于抗病虫育种研究中的极大潜力。因此，构建RNA干扰载体，在植物上表达根结线虫重要基因的dsRNA，是植物抗根结线虫基因工程研究中很有意义的新方向，有利于培育新型的转基因抗线虫作物。ganO.,JohnsonS.,PlaetinckG.,MunyikwaT.,PleauM.,VaughnT.,andRobertsJ.,2007,Controlofcoleopteranin-sectpeststhroughRNAinterference,NatureBiotechnology,25:BirdD.M.,2004,Signalingbetweennematodesandplants,Cur-rentOpinioninPlantBiology,7(4):372-376BoutlaA.,KalantidisK.,TavernarakisN.,TsagrisM.,andTablerM.,2002,InductionofRNAinterferenceinCaenorhabditiselegansbyRNAsderivedfromplantsexhibitingpost-tran-scriptionalgenesilencing,NucleicAcidsResearch,30(7):Castagnone-SerenoP.,2002,Geneticvariabilityofnematodes:athreattothedurabilityofplantresistancegenes?Euphytica,124(2):193-199Castagnone-SerenoP.,2006,Geneticvariabilityandadaptiveevolutioninparthenogeneticroot-knotnematodes,Heredity,96:282-289ChenG.H.,YangY.H.,andXieB.Y.,2007,Novelwaysandap-plicationinmolecularbreedingofplantgeneticengineeringfornematoderesistance,ZhiwuBingliXuebao(ActaPhy-topathologicaSinica),37(2):113-120(陈国华,杨宇红,谢丙炎,2007,植物抗线虫基因工程新途径及其在分子育种中的应用,植物病理学报,37(2):113-120)ChitwoodD.J.,2003,Researchonplant-parasiticnematodebiol-ogyconductedbytheunitedstatesdepartmentofagricul-ture-agriculturalresearchservice,PestManage.Sci.,59(6-7):748-753Dafny-YelinM.,ChungS.M.,andFrankmanE.L.,2007,pSATRNAivectors:amodularseriesformultiplegenedown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