一种肺癌骨转移荧光定量pcr检测试剂盒的制作方法
专利名称一种肺癌骨转移荧光定量pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域本发明涉及小RNA检测试剂盒的制备及使用方法，具体而言，本发明涉及以新发现小RNA前体的核苷酸序列为基础，设计特异的寡聚核苷酸引物和荧光标记探针，采用实时荧光定量PCR技术组装肺癌骨转移的检测试剂盒，本发明也涉及其检测方法。
背景技术肺癌是当今世界上肿瘤患者死亡的首位病种，且其发病率和死亡率呈上升趋势，严重威胁着人类健康和生命。2000年全世界肺癌新发病例120万，死亡110万。造成肺癌高病死率的主要原因是早期肺癌因无症状而发现困难，当出现症状就诊时，大多已经比较严重或已肺外转移，到了临床不可治愈的阶段。肺癌易发生骨转移，有研究表明肺癌骨转 移发生率为 22% -81. 8%。(Lack E, Dickgreber N, Muller T, et al. Randomized PhaseIII study of Gemcitabine and Vinorelbine versus Gemcitabine， Vinorelbine， andCisplatin in the treatment of Advanced Non-Small-Cell lung cancer From theGerman and Swiss Lung Cancer Study Group[J]. Journal of clinical Oncology，) :)骨转移的常见临床症状包括程度不等的疼痛、病理性骨折、脊髓受压以及危及生命的高I丐血症等，统称骨相关事件(Skeletal related events, SREs)。骨转移瘤所引起的疼痛等症状往往成为肺癌患者的最大痛苦，对患者造成严重的心理影响，是临床上降低肺癌患者生活质量和影响患者生存的重要因素。肿瘤的浸润和转移是决定肿瘤患者预后的一个关键因素。大部分患者并不是死于原发部位的肿瘤，而是死于肿瘤其它部位的扩散转移。所谓肿瘤的转移，是指肿瘤细胞从原发肿瘤部位脱离，迁徙到其他位点，不断生长，最终发展为转移性肿瘤。人们很早就发现，肿瘤的转移不是随机性的，而是有选择性，具有嗜器官性的。肿瘤骨转移，是肿瘤转移研究中最早观察到的现象之一。骨骼的主要组成是矿物质成分，其微环境对肿瘤细胞而言可谓严酷，但乳腺癌、前列腺癌、肺癌却极易发生骨转移，这暗示能够转移至骨的肿瘤细胞具有改造局部微环境的特性。肿瘤骨转移过程涉及一系列复杂的分子事件，是多步骤、多因素、多基因共同参与的复杂过程，肿瘤细胞首先从原发灶中分离，通过侵袭透过肿瘤新生血管进入全身循环系统，在其中绝大多数癌细胞由于宿主免疫反应和血流物理压力而灭亡，只有极少量癌细胞可以存活，进入骨髓腔的窦状小管，而后穿过窦状小管的壁，侵袭骨髓基质，癌细胞与局部骨组织微环境发生一系列复杂的相互作用，导致癌细胞增殖分化，局部骨质破坏，形成骨转移灶。肺癌骨转移绝大多数为溶骨性转移，最初人们认为肿瘤骨转移引起溶骨性骨质破坏是肿瘤细胞直接作用引起的，然而研究证实到达局部骨组织的肿瘤细胞，并不能直接破坏骨组织，而是通过分泌多种细胞因子，包括甲状旁腺激素(PTH)、甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)、IL-U IL-6、前列腺素E2等，直接或间接的作用于骨组织中破骨细胞，激活破骨细胞引起局部骨吸收作用异常活跃，使局部出现溶骨性的骨质破坏，为肿瘤细胞的“定居”和扩展提供了空间。同时骨基质中富含有多种生长因子，包括转化生长因子(TGF-β)、纤维母细胞生长因子(FGF)、胰岛素生长因子(IGF)、血小板源性生长因子(TOGF)和骨形态发生蛋白(BMP)等。溶骨性骨破坏的过程中，大量生长因子获得释放并被激活，刺激肿瘤细胞分裂增殖，同时增多的肿瘤细胞进一步刺激破骨细胞分化，骨质破坏进一步加重，这样就形成了一个恶性循环，从而导致溶骨性转移灶的形成。microRNA(miRNA)是天然存在、长约22个核苷酸的非编码RNA，它们介导了转录后的基因调控。miRNAs在许多生物过程中扮演了重要角色，包括分化和发育、细胞信号通路以及对感染的反应。miRNAs表现出一种转录后调控基因表达的全新机制，它通过结合靶基因的mRNA的3’ UTR抑制基因的表达。miRNAs已经被证实在发育、感染、免疫应答、炎症反应和肿瘤的发生等多种生理与病理过程中发挥作用。从最初发现到现在，已经在哺乳动物中发现了 700多个miRNAs，其中绝大部分miRNAs的生物学功能是未知的。已有报道，miRNAs参与免疫应答中多方面的调控作用。研究还发现血清和血浆中可以检测到循环miRNAs，且它们的表达因疾病而异，这一发现说明循环miRNAs的表达特征可作为疾病诊断和预防的 生物标志物，具有巨大潜力。而缺乏特异的、高敏感度的分子标志物是目前制约肺癌骨转移早期诊断以及有效治疗的关键问题。
本发明的目的是提供一种检测小RNA表达水平的荧光定量PCR试剂盒及使用方法，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。本发明的另一目的是在于提供一种荧光定量PCR试剂盒对肺癌是否发生骨转移进行快速的检测。为了实现上述目的，本发明首先分别提取了肺癌发生骨转移患者肿瘤细胞和肺癌未发生骨转移患者肿瘤细胞的总RNA,并从中纯化miRNA,利用Single-end library建库方法，共得到两个肺癌骨转移前后肿瘤细胞miRNA转录组文库。对所得的miRNA转录组文库进行高通量测序，对高通量测序序列过滤，去除低质量序列，使用S0AP2方法跟人类基因组进行比对。并对测序结果进行分析，其中通过fold-change方法，对不同样本的表达差异基因进行了比较，得到了表达差异显著的miRNAnovel_mir_54，其序列见SEQ NO. 5。本发明根据nOVel_mir_54的序列信息，设计了四条引物，第一条为茎环状结构的反转录引物RT54，其序列见序列表SEQ NO. I ;第二条是上游的特异引物F54，其序列见序列表SEQ NO. 2 ;第三条为下游的通用引物R54，其序列见序列表SEQ NO. 3 ;第四条是在荧光定量PCR中需要的荧光探针引物Flu54，其序列见序列表SEQ NO. 4，在荧光探针Flu54的5’端标有荧光基因FAM，在荧光探针Flu54的3’端标有荧光淬灭基团TAMRA。本发明还制备了含有noVel_mir_54序列的标准DNA模板。制备步骤方法如下使用TRNzol试剂抽提肺癌骨转移前肿瘤细胞的RNA，接着进行逆转录反应，反转录体系为茎环状结构的反转录引物RT54，SEQ ID NO. I (2 μ mol/L) I μ 1，细胞总RNA4 μ 1，dNTP混合物(每种 2. Smmol /I,) 4 μ 1,0. lmol/L DTT2 μ I, SuperScript RNase H 逆转录酶(200U/μ I) 2 μ I。反应条件为37°C水浴60分钟，95°C水浴3分钟。将逆转录反应得到的cDNA进行常规PCR扩增，PCR产物检测后切胶回收并纯化，将纯化产物连接到PGM-T克隆载体上，随后转化到DH5a感受态细胞中。通过序列为SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3的特异性引物筛选阳性克隆。阳性克隆扩增后提取质粒DNA，质粒DNA采用NanoDrop ND-1000核酸定量仪定量(NanoDrop Technologies, Wilmington, Delaware)并做10倍系列稀释作为标准品用于标准曲线的制备。本发明还制备了一种检测novel_mir_54表达水平的突光定量PCR试剂盒,组分如下特异性引物、特异性探针、标准DNA模板、荧光定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ IDN0.2，下游引物序列为SEQ ID NO. 3，特异性探针的核苷酸序列见序列表SEQN0. 4，在荧光探针的5’端标有荧光基因FAM，在荧光探针的3’端标有荧光淬灭基团TAMRA。本发明还公开了一种检测肺癌是否发生骨转移的荧光定量PCR试剂盒的使用方法，荧光定量 PCR 体系Hot-start Taq DNA 聚合酶(2. 5U/μ I) I μ 1，Hot-start Taq DNA聚合酶的 IOXbuffer 5 μ I, dNTP 混合物(每种 10mmol/L) I μ I,上游引物(10 μ mol/L), 下游引物(10 μ mol/L)，TaqMan探针(5 μ mol/L)各I μ 1，样品cDNA5 μ I或标准DNA模板DNA2 μ 1，加离子水至50 μ I。荧光定量PCR程序5°C IOmin预变性，接45个循环95°C 40s，60 °C Imin0本发明还公开了一种肺癌骨转移的检测方法，包括样品miRNA的提取、样品eDNA的制备、novel_mir_54的扩增。以上所述的样品miRNA的提取、样品eDNA的制备、novel_mir_54前体的扩增的具体步骤包括I)样品miRNA的提取按Trizol法提取肺癌骨转移的肿瘤细胞的总RNA，从总RNA中纯化miRNA ；2)样品cDNA的制备将提取的miRNA的反转录为cDNA，反转录体系为反转录引物 RT54 SEQ ID NO. I (2 μ mol/L) I μ I, miRNA4 μ 1，dNTP 混合物(每种 2. 5mmol/L) 4 μ 1，O. lmol/L DTT2 μ I, SuperScript RNase H 逆转录酶(200U/ μ1)2μ1(购自 Invitrogen 公司)反应条件为37°C水浴60分钟，95°C 3分钟；3)novel_mir_54的扩增以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。其中cDNA 模板 300ng, Hot-start Taq DNA 聚合酶(2. 5U/ μ I) I μ I, Hot-start TaqDNA 聚合酶的 IOXbuffer 7 μ I, dNTP 混合物 I μ 1，特异性引物 SEQ ID NO. 2，下游引物 SEQ ID NO. 3，荧光探针引物Flu54 1μ 1，去离子水补齐至50μ I。荧光定量PCR程序为95°C IOmin预变性，接 45 个循环95°C 40s，60°C Imin。本发明还检测了本试剂盒灵敏性，结果显示本试剂盒检测范围为107-102COpieS/μ tl,最小检出浓度为IOOcopies/ μ I。通过对阳性样品的检测，发现本试剂盒检测准确率为95%。连续3次重复实验，实验结果稳定。
图I小RNA长度在样本A和B的分布。样本A为肺癌未转移病人的肿瘤细胞miRNA转录组数据，样本B为肺癌骨转移病人的肿瘤细胞的miRNA转录组数据。
图2各浓度下标准DNA模板的PCR扩增曲线。曲线从左到右依次为浓度为108、107U06U05U04U03U02个拷贝/ μ I的标准DNA模板的PCR扩增曲线。图3标准DNA模板荧光定量PCR的标准曲线。图4noVel_mir_54在正常人和肺癌骨转移病人中的表达变化，其中I为正常人novel_mir_54的表达量；2为肺癌骨转移后病人noVel_mir_54的表达量；3为阳性质粒(IOOcopies)。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。实施例I肺癌骨转移前后肿瘤细胞microRNA表达的变化
一材料和方法I、材料肿瘤细胞均来自于云南肿瘤医院2004年-2010年因肺癌住院病例，分别取30例肺癌骨转移病人的肿瘤细胞和30例肺癌未转移病人的肿瘤细胞。2、方法2. I肺癌骨转移前后肿瘤细胞总RNA的提取按Trizol试剂盒说明书提取肺癌骨转移病人和肺癌未转移病人肿瘤细胞的RNA，通过凝胶电泳证明RNA的完整性，用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度。采用上海华舜生物工程有限公司总RNA抽提试剂盒子提取。主要操作步骤如下(I)用胞裂解液BL裂解组织细胞，离心取上层细胞。在上层细胞中加入Iml的Trizol，用带针头的一次性注射器抽打裂解物10次。(2)静置5分钟后，加入200 μ I的氯仿，用力颠倒离心管混匀后，室温静置使之分层，12000g离心5分钟，小心移取水相至I. 5ml的离心管中。(3)加入等体积的异丙醇，彻底混匀后，取出750 μ I移入吸附柱，离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一收集管中，将剩余的全部将入吸附柱中，离心30秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一个收集管中。(4)加入500 μ L RP液，离心30秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一收集管中。(5)将500 μ 11的W3液，静置I分钟，离心15秒。(6)将吸附柱移入一个干净的收集管中，加入500 μ I W3液，离心15秒。(7)到掉收集管中的液体，再将吸附柱移入同一收集管中，离心I分钟。(8)将吸附柱放入另一个干净的I. 5ml的离心管中，在吸附膜中央加入50 μ I纯水，室温静置I分钟后，离心I分钟。将RNA贮存于-70°c。(9)总RNA完整性鉴定取2 μ I RNA样品在I. 5%琼脂糖凝胶电泳(80v，15min)，分出区带后，EB染色，紫外灯下观察电泳区带。(10)用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度2. 2、肺癌骨转移前后肿瘤细胞miRNA转录组文库的构建及测序利用QIAGEN公司的RNeasy MinElute Cleanup Kit从上述得到的总RNA中纯化miRNA,具体步骤见说明书。利用Single-end library建库方法,共得到两个肺癌骨转移前后肿瘤细胞miRNA转录组文库。将上述miRNA转录组文库进行高通量测序，对高通量测序序列过滤,去除低质量序列，使用S0AP2方法跟人类基因组进行比对。2. 3、生物信息学分析生物信息学分析流程Illumina测序所得50nt序列，通过去接头、去低质量、去污染等过程完成数据处理得到干净序列，对其进行序列长度分布的统计及样品间公共序列统计。将清理后的干净序列分类注释，可以获得样品中包含的各组分及表达量信息。将所有小RNA片段注释后，用预测软件Mireap对未得到注释片段进行新的miRNA预测。·具体生物信息学内容如下数据处理对原始数据进行去除接头、污染序列及低质量reads的处理，并统计sRNA的长度分布,标准信息分析(I)分析样品间的公共序列及特有序列；(2)探索sRNA在选定的参考基因组上的分布；(3)通过与Rfam(9. I)数据库以及Genbank的比对,鉴定rRNA、tRNA、snRNA等非编码RNA ；(4)通过与miRNA数据库(miRBasel6. O)中指定范围的miRNA进行比对,鉴定样品中的已知miRNA ；(5)分析已知miRNA的表达模式；(6)通过与重复序列的比对，鉴定与重复序列相关的sRNA ；(7)通过与外显子、内含子的比对鉴定mRNA降解片段；(8)按照优先级对sRNA进行分类注释；(9)利用Mireap对没有注释的sRNA进行预测预测新的miRNA,绘制新的miRNA的二级结构图；(10)参照Audic S.等人发表在Genome Research上的基于测序的差异基因检测方法，分析了肺癌骨转移前后病人的肿瘤细胞miRNA的差异表达。二结果通过使用Illumina Solexa Hiseq2000,利用 Single-end library 建库方法,共得到两个miRNA转录组数据，分别为A和B，A为肺癌未转移病人的肿瘤细胞miRNA转录组数据，B为肺癌骨转移病人的肿瘤细胞的miRNA转录组数据。I. small RNA测序结果概述对这些初步的35nt左右的原始reads做去接头,去低质量reads,去污染等处理，得到高质量的测序reads，其中A有25 100 000个reads，B有24 600 000个reads，后续分析均以此为基础。首先对小RNA做长度分布统计，一般来说，miRNA集中在21或22nt，siRNA集中在24nt，piRNA集中在30nt。2个样本的small RNA均在22nt位置呈现出明显的单峰结构(如图I)，说明其大多数为miRNA。A组中20— 24nt的sRNAs占细胞总sRNA的51. 61%,B组中20—24nt的sRNAs占细胞总sRNA的52. 28%。样品中reads做分类注释，得到2个样本中各种小RNA的比例。其中miRNA的含量最高，其次是未注释的RNA(unarm),其可能为siRNA和未发现的miRNA。2.新miRNA候选基因的预测将clean reads序列做分类注释，我们获得样品中各类小RNA的表达信息，其包括miRNAs, rRNA, tRNA, scRNA, snRNA, snoRNA,重复序列相关小 RNA，mRNA 相关 RNA 和未注释的小RNA。除表达量最高的miRNAs之外，其次就是未注释的小RNA。
对新miRNA的生物信息学预测，是基于已知的miRNA加工成熟中的特点来实现的，长度为18-25nt，其对应前体的位置能够形成发夹样结构，我们是利用miRNA预测软件Mireap (https: //sourceforge. net/pro jects/mireap/)进行的，预测 miRNA 主要是根据miRNA的特殊结构1、候选发夹状结构的上游高度保守的模序的存在；2、sRNA必须在远离发夹结构环，位于发夹结构两臂上；3、酶切位点的保守性，一般的miRNA酶切位点不会偏移超过3个碱基；4、发夹前体要有较低的折叠自由能能量。分析发现了一些新的miRNA候选基因，共107条，其中在骨转移前88条，骨转移后76条。3.肺癌骨转移前后病人的肿瘤细胞miRNA的差异表达分析为了分析肺癌骨转移前后病人miRNA的差异表达，先将A、B两个miRNA转录组的各个miRNAs标准化，某miRNA标准化表达=某miRNA实际数量X 1000000/转录组中reads的总数。如果某个miRNA在两个转录组中的标准化reads之和小于1，则被剔除不再分析，如果某个miRNA在其中一个转录组中的表达值为O则其标准表达值为O. 01。倍数变化(fold-change)计算为Log2 (实验组/对照组)。用下面方法计算P值
^ /师名Li和Σ妒Wx)
1 办》0+#产成! p{y\x)倍数变化值大于I则认为miRNA表达上调，倍数变化值小于_1则认为miRNA表达下调，特别是当P值小于0. 05时，具体结果见表I :表I肺癌骨转移前后病人的肿瘤细胞miRNA的差异表达
1.一种novel_mir_54的反转录引物,其特征在于,所述的反转录引物其核苷酸序列为SEQ ID NO. I。
2.—种novel_mir_54的特异性引物和特异性探针,其特征在于,所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3，所述的特异性探针的核苷酸序列为SEQ ID NO. 4。
3.—种检测肺癌骨转移的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求2所述的特异性引物和特异性探针。
4.根据权利要求3所述的一种检测肺癌骨转移的荧光定量PCR试剂盒，还包括标准DNA 模板、Hot-start Taq DNA 聚合酶,其浓度为 2. 5U/μ I, Hot-start Taq DNA 聚合酶的IOXbuffer, dNTP 混合物，每种 NTP 浓度为 10mmol/L。
5.一种肺癌骨转移的检测方法，包括样品miRNA的提取、样品cDNA的制备、novel_mir_54的扩增。
6.根据权利要求4中所述的样品miRNA的提取、样品cDNA的制备、novel_mir_54前体的扩增的具体步骤包括
1)样品miRNA的提取按Trizol法提取肺癌骨转移的肿瘤细胞总RNA，从总RNA中纯化 miRNA ；
2)样品cDNA的制备将提取的RNA的反转录为cDNA，反转录体系为反转录引物RT54SEQ ID NO. I (2 μ mol/L) I μ 1，细胞总 RNA4 μ 1，dNTP 混合物(每种 2. 5mmol/L) 4 μ 1，O. lmol/L DTT2 μ I, SuperScript RNase H 逆转录酶(200U/ μ1)2μ1(购自 Invitrogen 公司)反应条件为37°C水浴60分钟，95。V 3分钟；
3)novel_mir_54的扩增以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。其中cDNA模板 300ng, Hot-start Taq DNA 聚合酶(2. 5U/ μ I) I μ I, Hot-start Taq DNA 聚合酶的10Xbuffer7y I, dNTP混合物I μ 1，特异性引物SEQ IDNO. 2，下游引物SEQ ID NO. 3，荧光探针引物Flu541y 1，去离子水补齐至50μ1。荧光定量PCR程序为95°C IOmin预变性，接 45 个循环95°C 40s, 60°C Imin0
7.权利要求I的引物和探针在制备检测肺癌骨转移试剂盒中的应用。
本发明公开了一种检测肺癌骨转移荧光定量PCR的试剂盒。该试剂盒包括以下成分特异性引物、特异性探针、标准DNA模板、荧光定量PCR反应液。本发明还公开了一种检测肺癌骨转移荧光定量PCR试剂盒的使用方法。利用该试剂盒可以快速定量检测novel_mir_54的表达量，从而检测肺癌骨转移的发生情况。本发明操作简便、快速、结果稳定、灵敏度高且特异性强。
文档编号C12Q1/68GKSQ
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者杨祚璋, 谢琳, 徐磊, 李国奇 申请人:杨祚璋503 Service Temporarily Unavailable
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PCR直接测序法与ARMS检测非小细胞肺癌EGFR基因突变
摘　要：目的 比较PCR直接测序法与蝎形探针扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system,ARMS）检测非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中EGFR基因突变的敏感性.方法 用直接测序发与ARMS法同时检测154例NSCLC中EGFR基因第18、19、20、21外显子的突变情况.结果 男性84例,女性70例,年龄33 ～ 86岁,手术切除标本71例、活检标本79例,其中鳞状细胞癌27例、腺癌121例、腺鳞癌2例;另4例为胸水.测序法32例突变（32/154,20.8％）,ARMS法52例突变（53/154,33.8％）.两种方法均检测到突变者29例,均无突变者99例,直接测序法检测到突变而ARMS法阴性者3例,反之23例,不一致率差异有显著性（P＜0.000 1）.结论 检测NSCLC中EGFR突变情况时,ARMS法较直接测序法操作步骤少,突变率高.
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