hbv-dna荧光定量pcr检测_百姓问医生
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hbv-dna荧光定量pcr检测
北雪撒盐南飞絮
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病情分析： 您好，鉴于患者的情况，建议到医院复查了解病情的回复情况，药物治疗方面建议在医生的指导下进行，不建议自行的用药，以免引起危险。希望我的回答给您带来帮助，祝您健康。
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乙型肝炎病毒（HBV）实时荧光定量PCR
[目的要求]
血清中HBV-DNA的提取方法及原理；HBV-DNA实时荧光定量PCR的测定原理； HBV-DNA实时荧光定量PCR实验操作及结果分析
核酸测定引物设计原理；实时荧光定量PCR仪的工作原理及操作。
[教学时数]
讲授2学时，实验6学时。
[讲授内容]
血清中病毒DNA的提取方法和原理；实时荧光定量PCR的测定原理；核酸测定引物设计原理；HBV-DNA测定引物设计思路；HBV-DNA荧光定量PCR试剂组成、相应作用及反应混合液配制；实时荧光定量PCR仪的工作原理及操作
[实验内容]
分组提取血清中HBV-DNA；配制反应液并上机操作，实时观察，结果分析；实验结果讨论；实验总结
[自学内容]
“感染性疾病的分子诊断”
实验指导（自编）
乙型肝炎病毒（HBV）实时荧光定量PCR
Real time PCR 是普通PCR 的一项改进，使用了针对扩增DNA 的荧光物质，使得DNA的数量与检测到的荧光强度成线性关系，大致得到DNA 的扩增曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。即对DNA靶分子的起始拷贝数进行定量的核酸检测。该方法精确、灵敏、特异性强、污染途径小、自动化程度高、操作简单。是国际公认的核酸分子
定量的标准方法。它已逐渐代替了Northern blotting 以及semi RT-PCR技术。
本实验从HBV携带者或者乙型肝炎患者血清中抽提HBV基因组DNA，采用核酸扩增结合TaqMan荧光探针技术, 利用一对乙肝病毒特异性引物和一特异性结合于扩增区另一位点的TaqMan探针, 实现对乙肝病毒模板的扩增和检测。使用商品化试剂盒：HBV实时荧光定量试剂盒，深圳匹基公司（PG，Biotech.）。针对表面抗原S基因，设计一对引物和一个探针。 TaqMan荧光探针技术中，两个荧光染料标记在探针上，一个叫报告基团（R），一个叫淬灭基团（Q）。当两个荧光基团都连在探针上时，报告基团的荧光被淬灭基团抑制。在延伸中，DNA聚合酶利用5’→3’外切酶活性把报告基团从探针上切下来。一旦和淬灭基团分开，报告基团释放出荧光。通过监测荧光信号的积累来反映乙肝病毒DNA的扩增.产物的积累，根据扩增反应的动力学特征使用外部标准曲线对初始模板定量（图4）。
图4：TaqMan荧光探针技术原理
R:荧光报告基团
Q：荧光淬灭基团
【试剂与器材】
1．HBV-DNA检测试剂盒：DNA提取液1，DNA提取液2，PCR预混合液（含有Mg2+、PCR反应缓冲液、dATP、dUTP、dGTP、dCTP引物、荧光标记的探针）、Taq酶、UNG，强阳性对照血清、阴性对照血清、临界阳性血清，四种不同浓度的阳性参控品、双蒸去离子水。
2．荧光定量PCR仪
3．PCR反应管
4．移液器及移液器吸头
5．高速离心机
6．漩涡混合器
7．超净工作台
8．调温电热板
【操作步骤】
试剂和主反应混合物的准备：从试剂盒中取出HBV PCR反应液、Taq酶及UNG。室温融化后，2000rpm离心10sec，设需要的管数为n（n=样本数+1管阴性对照+1管强阳性
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，充分混合均匀，向设定的n个PCR反映管中分别加入38ul，转移至样本处理区。
样本的制备和上样
（1）标本处理
取n个0.5ml灭菌离心管，做好标记。首先加入100ulDNA提取液1，再分别加入待测血清或血浆样本（切勿吸入血细胞）以及各种对照品各100ul，振荡混匀，13000rpm离心10min：吸弃上清（离心时注意固定离心管方向，尽可能吸弃上清且不碰沉淀）；再加入25ulDNA提取液2，振荡10sec（沉淀无需打散、混匀），100℃干浴，13000rpm离心10min，保留上清备用。如果样本裂解产物当天不使用，则要保存在-20℃。
若样本及对照品裂解产物保存在-20℃，使用前置室温解冻，以13000rpm离心5min。在所设定的n个反应管中分别加入步骤1中处理过的样本、阴性对照、强阳性对照和室内质控血清、灭菌去离子水以及阳性参控品各2ul，盖紧PCR反应管管盖，并记录样本信息。
PCR上机扩增
检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器；检查并消除反应管底气泡。按设置装载反应管，选择或设置扩增和检测条件：选择预设的程序文件或设置为：370C：3min；940C：1min；950C：5sec，600C：30sec，40个循环，荧光信号收集设在600C。设置模板：设置孔位及荧光（详见相应仪器的操作手册）。保存数据文件并运行。
（1）设置分析条件：
设定基线：不同的PCR仪操作略有不同，按仪器说明书操作。①PE7700:分析前把标准荧
光定为TAMRA。如果没有Ct&16的强阳性样品，应选3～15个循环的平均荧光信号作为基线再分析Ct；如果有Ct&16的样品，则将此样品定为强阳性，并将此样品从数据库中剔除，然后以3～15个循环的平均荧光信号作为基线再分析Ct。②ICycler：基线一般取自设值（2~10）。实验结束后，点击PCR baseline subtract选项扣除基线值。若某些曲线出现无规则的起伏跳动，应视为非正常现象，此时将其从结果中剔除（点击select wells,消除此孔彩色，然后选择display wells）。注意调整坐标，使所有曲线都在坐标内，见图5。③LightCycler：用荧光显示模式F1/F2读取结果。基线设定原则以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，且Ct值不出现任何数值时为准（一般定在0.001～0.01范围内，也可以根据仪器本身的实际情况加以调整）。
域值设定：以刚好高于阴性对照品的扩增曲线最高点，且阴性对照品Ct=40或Ct=0为原则，调整起始域值。
（2）实验有效性判断：检查质控和标准品应同时符合下列条件，见图5：（否则试验视为无效）
阴性对照、试剂空白CT值都为0
强阳性对照和室内质控CT值不为0，且强阳性小于室内质控，拷贝数在105~107间。 标准品CT值小于38，且标准曲线斜率在-3.5 ~ -4.0间，截距在40 ~ 50间，相关系数小于-0.98。
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荧光定量PCR法HBV-DNA检测的临床意义
全网发布： 17:03
&&& 乙毒的英文缩写为HBV，因此化验单上往往写成“HBV-DNA”。DNA的检查也可以称作基因诊断，目前最常用的是“PCR法”。PCR是一种分子生物学方法，它的全称为：聚合酶链反应。这种方法是用一些特殊的仪器，将非常微量的DNA扩大百万倍，因此，灵敏度非常高。
荧光定量PCR法HBV—DNA定量检测的诊断价值：
　　1、荧光定量PCR法HBV-DNA检测治疗前进行病毒定量检测，可以选择针对性的药品，避免盲目用药。
　　2、荧光定量PCR法HBV-DNA检测治疗后定量PCR可直接准确地测定体内病毒数量，有助于判断治疗的效果
3、荧光定量PCR法HBV-DNA检测妊娠前进行定量PCR测定，有助于选择有益的妊娠机会。妊娠期的妇女进行定量PCR检查，有助于使部分患者得到及时、正确的诊断。
　荧光定量PCR法HBV—DNA定量检测指标降低在施治中有着非常重要的意义，是转阴的前奏，还是康复最为关键的一步，只有体内的HBV—DNA定量指标降低，病毒的克隆繁殖才会终止，的根治才有希望。HBV DNA正常值是&10的3次方(或&1.0e+03拷贝/ML是正常值，此值仅供参考，以检测医院数据为准)。无论HBV-DNA阳性还是阴性，都只是代表了乙毒的复制和传染性强弱，HBV-DNA值的多少和肝损伤的程度没有直接的关系。
乙毒的英文缩写为HBV，因此化验单上往往写成“HBV-DNA”。DNA的检查也可以称作基因诊断，目前最常用的是“PCR法”。PCR是一种分子生物学方法，它的全称为：聚合酶链反应。这种方法是用一些特殊的仪器，将非常微量的DNA扩大百万倍，因此，灵敏度非常高。
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　　1、荧光定量PCR法HBV-DNA检测治疗前进行病毒定量检测，可以选择针对性的药品，避免盲目用药。
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　荧光定量PCR法HBV—DNA定量检测指标降低在施治中有着非常重要的意义，是转阴的前奏，还是康复最为关键的一步，只有体内的HBV—DNA定量指标降低，病毒的克隆繁殖才会终止，的根治才有希望。HBV DNA正常值是&10的3次方(或&1.0e+03拷贝/ML是正常值，此值仅供参考，以检测医院数据为准)。无论HBV-DNA阳性还是阴性，都只是代表了乙毒的复制和传染性强弱，HBV-DNA值的多少和肝损伤的程度没有直接的关系。
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发表于： 14:52
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陈立侠的咨询范围：
检验技术、检验结果解释、检验结果与疾病诊断
检验科好评科室→ 乙肝病毒DNA定量HBV一DNA1、49
乙肝病毒DNA定量HBV一DNA1、49
健康咨询描述：
乙肝病毒DNA定量HBV一DNA1、49E07（阳性）IU／m丨低于检测下限TaqMan荧光PCR。这个严重吗？我是个孕妇。
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擅长: 内科和儿科综合疾病，尤其是小儿肾病
帮助网友：1268称赞：13
&&&&&&病情分析：&&&&&&你好，HBV-DNA是反应体内病毒数多少的指标，这个指标高的话，说明病毒复制活跃，处于活动期。&&&&&&这个指标主要看的是后面的指数，E07指病毒数是10的7次方拷贝级的，正常值为3，说明你病毒数较多，体内病毒活跃。&&&&&&指导意见：&&&&&&还要结合你的肝功能检查，和两对半检查结果，如果是小三阳病毒数大于10的4次方，大三阳大于10的5次方，合并转氨酶升高，就要进行抗病毒治疗。&&&&&&如果是小三阳病毒数大于10的4次方，大三阳大于10的5次方，转氨酶正常，但干组织活检显示坏死，也需要抗病毒治疗。
疾病百科| 乙肝
挂号科室：肝病科
温馨提示：管理传染源，切断传播途径，保护易感人群。
乙型病毒性肝炎(viral hepatitis type B，简称乙肝)系由乙肝病毒(HBV)引起，以乏力、食欲减退、恶心、呕吐、厌油、肝大及肝功能异常为主要临床表现。部分病例有发热和黄疸;少数病例病...
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