抗伪狂犬病毒单克隆抗体的制备及gB基因编码蛋白抗原表位的表达--《河南科技大学》2011年硕士论文
抗伪狂犬病毒单克隆抗体的制备及gB基因编码蛋白抗原表位的表达
【摘要】：猪伪狂犬病( Pseudorabies , PR)是由猪伪狂犬病病毒( Pseudorabies virus, PRV)引起的一种高度接触性、急性传染病。PRV属疱疹病毒科(Herpesviridae)α疱疹病毒亚科,我国1948年首次报道猫的伪狂犬病,根据2006年夏的统计结果,PR流行范围已扩大到31个省、市(区),包括香港和台湾在内,对我国的养殖业造成了巨大的经济损失,因此,建立有效的诊断检测方法对控制和消灭PR具有重要的意义。本研究筛选出分泌抗PRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株;利用原核表达系统表达了PRVgB基因主要抗原区蛋白。
1、PRV杂交瘤细胞株的筛选及单抗制备:
将伪狂犬病毒Batha株接种于BHK-21细胞,病毒增殖后,将细胞培养物反复冻融三次后,收集病毒,利用差速离心法和蔗糖密度梯度离心法分离纯化病毒,利用纯化的伪狂犬病毒免疫BALB/c小鼠,经三免后,取合格小鼠的脾脏细胞与NS0骨髓瘤细胞进行融合,利用ELISA和免疫组化方法筛选杂交瘤细胞,采用有限稀释法对其进行亚克隆,最终获得2株稳定分泌抗猪伪狂犬病毒的杂交瘤细胞株,即2B2-C1和3F1-A1。特异性实验结果表明:2B2-C1和3F1-A1不与猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒以及正常BHK-21细胞反应,特异性良好。两株PRV单抗的获得,为进一步建立特异、敏感、准确快速的PRV检测方法打下了基础。
2、PRV gB基因主要抗原区的克隆及原核表达:
依据Genbank发表的PRV gB基因序列,设计一对特异引物,通过PCR方法扩增出PRV gB基因片段(264bp),并将其克隆于pET-28a表达载体,构建后的表达质粒命名为pET-28a-gB,将pET-28a-gB转入BL21工程菌,通过IPTG诱导培养后,经SDS-PAGE和Western blotting分析,结果表明, gB基因片段在BL21工程菌中得到了高效表达,表达蛋白条带大小约为16 kDa,该表达蛋白能够被PRV阳性血清识别。PRV gB基因主要抗原区的表达为gB蛋白单抗的筛选及建立gB抗体检测奠定了基础。
【关键词】：
【学位授予单位】：河南科技大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2011【分类号】：S852.65【目录】：
ABSTRACT4-9
第1章 文献综述9-25
1.1 伪狂犬病研究进展9-11
1.1.1 伪狂犬病的流行现状9-10
1.1.2 伪狂犬病的流行病学研究10-11
1.1.3 伪狂犬病的临床症状11
1.2 伪狂犬病的诊断方法11-13
1.2.1 临床诊断和病理组织学检查11
1.2.2 动物接种试验11
1.2.3 血清学诊断方法11-13
1.2.4 分子生物学诊断13
1.3 伪狂犬病的防治办法13
1.4 伪狂犬病毒特征13-17
1.4.1 伪狂犬病毒的基因组14
1.4.2 伪狂犬病毒的主要糖蛋白14-15
1.4.3 伪狂犬病毒的感染，增殖和释放15-16
1.4.4 伪狂犬病毒的侵染途径16-17
1.5 单克隆抗体技术及其应用17-19
1.5.1 单克隆抗体技术17
1.5.2 单克隆抗体研制现状17-18
1.5.3 单克隆抗体的应用18-19
1.6 原核表达系统研究19-24
1.6.1 大肠杆菌表达系统19-21
1.6.2 外源基因在大肠杆菌细胞中的表达21-23
1.6.3 pET 表达系统23-24
1.7 本研究的意义24-25
第2章 猪伪狂犬病毒杂交瘤细胞株的建立25-49
2.1 试验仪器和材料25-28
2.1.1 主要实验材料25
2.1.2 主要仪器设备25-26
2.1.3 主要培养基的配制26
2.1.4 主要试剂的配制26-28
2.2 试验方法28-35
2.2.1 伪狂犬病毒的培养、纯化和鉴定28-30
2.2.2 免疫接种30-31
2.2.3 抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定31
2.2.4 杂交瘤细胞的制备31-32
2.2.5 阳性杂交瘤细胞孔的筛选32-33
2.2.6 阳性杂交瘤细胞的克隆33-34
2.2.7 杂交瘤细胞培养上清效价及特异性的测定34
2.2.8 杂交瘤细胞的扩大培养与保存34
2.2.9 单克隆抗体的大量制备34-35
2.2.10 单克隆抗体效价的及特异性测定35
2.3 实验结果及分析35-45
2.4 讨论45-49
第3章 gB 基因编码蛋白抗原表位区的表达49-63
3.1 主要试剂盒、酶、载体和细胞49
3.2 主要试剂49-50
3.3 试验方法50-54
3.3.1 引物的设计与合成50
3.3.2 伪狂犬病毒模板DNA 的提取50
3.3.3 PCR 最佳退火温度的确定50
3.3.4 目的片段的克隆50-51
3.3.5 目的片段的回收51
3.3.6 目的片段与T 载体的连接51
3.3.7 大肠杆菌感受态细胞的制备51
3.3.8 重组质粒pMD18-T-gB 的转化51-52
3.3.9 质粒DNA 的提取52
3.3.10 重组质粒pMD18-T-gB 的鉴定52
3.3.11 重组质粒pMD18-T-gB 的双酶切52
3.3.12 原核表达载体pET-28a 的双酶切52
3.3.13 回收目的片段52-53
3.3.14 目的基因与pET-28a 载体的连接53
3.3.15 重组质粒pET-28a-gB 的转化53
3.3.16 质粒DNA 的提取53
3.3.17 重组质粒pET-28a-gB 的鉴定53
3.3.18 重组质粒在大肠杆菌 BL21 中的诱导表达53
3.3.19 表达蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析53-54
3.3.20 表达产物的Western-Blot 鉴定54
3.4 试验结果及分析54-60
3.5 讨论60-63
第4章 结论63-64
4.1 猪伪狂犬病毒杂交瘤细胞株的建立63
4.2 gB 基因编码蛋白抗原表位的表达63-64
参考文献64-67
缩略词67-68
攻读硕士学位期间的研究成果69
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京公网安备74号请问我这情况需要打抗狂犬病免疫球蛋白吗？
时间： 15:38:23
健康咨询描述：
昨天18号遇到一条很小的狗，很冷吧躲在一块石头下，下午13:30右手中指不小心被狗咬伤，伤口大约长4至5毫米，宽一毫米，慎了几滴血，那狗可能是人家不要的吧，狗身上是干净的不是很脏，狗颈上围了一圈绳
曾经的治疗情况和效果：
16:50去打了狂犬病疫苗，但没有打抗狂犬病免疫球蛋白，打哪狂犬病疫苗和打抗狂犬病免疫球蛋白得2000多元，光打狂犬病疫苗360元
想得到怎样的帮助：请问我这情况需要打抗狂犬病免疫球蛋白吗？（感谢医生为我快速解答——该。）
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擅长: 老年病，慢性病，对高血压，糖尿病，消化系统疾病有数
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病情分析：你好,根据你的描述,你的暴露伤口不打,可以只打狂犬病疫苗一套,咬伤后预防注射时间是0,3,7,14,30天,需要按时间注射.注射疫苗期间可照常工作,但切忌饮食酒,浓茶等刺激性食物及进行剧烈劳动,以避免引起反应.指导意见：伤口要即时处理,最好是在咬伤后几分钟内对伤口进行清洗消毒，对预防狂犬病具有非常重要的意义,可以先用3%-5%肥皂水或0.1%新洁尔灭或再用清水充分清洗;伤口不宜包扎应尽可能暴露.
但是按卫生部狂犬病暴露分级处置原则属于3级啊，属于3级的话两种都要打的？
谢谢,我去年（2010年）半年前家里有一只猫，以前那猫不是我家的，是跑到我家的，只活了几个月就死了，（2010年8月以前死的，具体什么时候死的已忘记了，大概也就是5月--8月死的）当时口吐泡沫好像维持了10几个小时，劲上有被咬过的伤掉了点皮。在死之前我经常接触那猫，甚至抱它，经常逗它玩。我想请问下如果前几天没被狗咬，单独这猫事情不知道会不会有事情，谢谢！
11:26医生回答：
根据你说的那只猫的症状,可能是被别的有狂犬病的狗猫咬伤后发病死亡的,如果你没有接触它的唾液,或者被它抓伤咬伤,应该是不会被传染.
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病情分析：你好：你的情况伤口比较小，而且狗不一定就是在发病期的狗。所以不要太担心。指导意见：你可以只注射疫苗，不用注射免疫球蛋白。只要按时注射疫苗就可以了，注射疫苗后，忌食辛辣刺激食物和剧烈运动就可以了
但是按卫生部狂犬病暴露分级处置原则属于3级啊，属于3级的话两种都要打的？
谢谢,我去年（2010年）半年前家里有一只猫，以前那猫不是我家的，是跑到我家的，只活了几个月就死了，（2010年8月以前死的，具体什么时候死的已忘记了，大概也就是5月--8月死的）当时口吐泡沫好像维持了10几个小时，劲上有被咬过的伤掉了点皮。在死之前我经常接触那猫，甚至抱它，经常逗它玩。我想请问下如果前几天没被狗咬，单独这猫事情不知道会不会有事情，谢谢！
08:48医生回答：
你好：就算那只猫有狂犬病，那么你接触它是不好得病的。而且你没有被它咬，也没有新鲜的伤口接触它的唾液那么是不会感染的。你可以放心
你好：你的情况伤口比较小，而且即使注射了疫苗。如果当时狗有发病的表现，那么就需要注射免疫球蛋白。如本没有那么注射疫苗就可以了。不用担心。你自己不放心的话也可以注射球蛋白的
谢谢,我去年（2010年）半年前家里有一只猫，以前那猫不是我家的，是跑到我家的，只活了几个月就死了，（2010年8月以前死的，具体什么时候死的已忘记了，大概也就是5月--8月死的）当时口吐泡沫好像维持了10几个小时，劲上有被咬过的伤掉了点皮。在死之前我经常接触那猫，甚至抱它，经常逗它玩。我想请问下如果前几天没被狗咬，单独这猫事情不知道会不会有事情，谢谢！
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狂犬疫苗和狂犬免疫球蛋白有什么区别？
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进入人体病毒潜伏久意味着可以晚一点病发,但都是为防病.感染狂犬病毒后体内会有微量免疫蛋白(抗体)直到病发死掉,可见只要有病毒就会有免疫蛋白,总之病毒和疫苗是抗原到体内让人体消耗自身的氨基酸合成免疫球蛋白(抗体),理论上被咬的人都很难死(感染环节里感染后死者大都为不注射疫苗的年幼体弱者),由于狂犬病毒变异性差繁殖慢所以允许直接注射免疫蛋白,针对狂犬病直接打免疫蛋白效果比打疫苗更快,狂犬病毒变异性还可以,疫苗可以晚点打不要紧:我认识的有很多老人被狗咬过都活的好好的到80才过世,疫苗就是微量病毒这2者虽然不可同日而语,狂犬病发必死无疑
　本人是疾病预防控制中心（原来叫防疫站）的工作人员，长期从事地方病预防工作（狂犬病属于地方病的一种）。
通俗地说：抗狂犬病免疫球蛋白是抗体,注射后直接与狂犬病毒(也就是抗原)结合,起到预防狂犬病的作用;狂犬病疫苗是减毒后的对人体无害的狂犬病病毒(也就是无害抗原),注射后通过刺激机体产生狂犬病毒抗体,再与狂犬病毒结合,达到预防狂犬病的作用;由...
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说直白点就是一种起预防作用，使机体在真正的狂犬病病感染产生症状前产生抗体，而另外就是在感染狂犬病毒后短期内人为注射抗毒素。
前者是抗原，后者是抗体。后者可以消灭前者。
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出门在外也不愁需要打狂犬病人免疫球蛋白吗？_百度知道
需要打狂犬病人免疫球蛋白吗？
说话的语速有点吓唬人(当时我真不想让他看的。 然后我去到 医院。然后30号上午我就带它去看兽医，就说我不仅要打 狂犬病疫苗;？（今年一月份已打过5针狂犬病疫苗，&quot，30号，伤口可能碰到它的唾沫（伤口碰到水或唾沫 会疼）患者信息。请问这种情况有必要 打 狂犬病人免疫球蛋白 吗？谢谢，因为狗狗（算属于蝴蝶品种）生病了，比较严重：上周29。 兽医说 犬瘟热 不会传染给人的。而且我知道 咬伤严重者和大面积咬伤才要打狂犬病人免疫球蛋白，3天没吃饭，治愈率小，我也用滴露消毒水和肥皂洗手了，喂完食后，我喂它吃药&#47，然后就给它打了针看看情况它是否有机会可以治愈、主要症状等)：女 28岁 广东 深圳 病情描述(发病时间，严重。（再加上狗狗4月中旬才打了狂犬疫苗）所以这次我自己判断！想得到怎样的帮助，兽医说它的症状很明显是得了犬瘟热，5月底 喂有 犬瘟热的狗 进食时，手指上的小伤口 可能碰到它 的唾沫，他也只叫我打 狂犬病疫苗。（因为我家狗狗最近有经常出去溜达）听后我就担心自己的伤口碰到它的唾沫 会不会感染到病毒;食物时，手指上有小伤口。他说如果我不同意打 狂犬病人免疫球蛋白，还要打狂犬病人免疫球蛋白，在“打疫苗知情通知书”那里勾了 属于三级伤（也只有这一级才要求打狂犬病人免疫球蛋白）。有专业人士 和 同样经历的人可以分享下你们的意见 和 经历 吗;就签名 后果自付&quot，24小时内到医院 打了两针，有些得了犬瘟热的狗狗严重的 可能一个星期就死了，没听这个医生的话，只选择了 再打一次 狂犬病疫苗：今年1月份已打过5针狂犬病疫苗，有些可以拖到一个月甚至更长时间，奈何旁边的医生忙）因为我想今年1月底曾被其他狗牙齿刮伤， 但是如果我不放心 就去医院打一下疫苗，这次也是在怀疑伤口碰到有犬瘟热的狗狗的唾沫后，24小时内已到医院打了两针 狂犬病疫苗？谢谢，那医生都还没听我说完我的情况。我想问下 这种的情况 要打 狂犬病人免疫球蛋白 吗，去同样的医院看？ 如果没打，不同的医生，会有什么最坏的结果
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建议你百度搜索一下祖述宪教授的新浪博客，上面有狂犬病知识的普及，是被疑似病犬咬到后打第一针疫苗，犬瘟热是狂犬病毒吗。希望能帮到你，然后隔离观察十天没听说过犬瘟热要打狂犬病毒疫苗，而且疫苗也不单独出售，那可以停下余下的治疗就是不用打剩下的疫苗了，这个观察法是针对狂犬病毒的，若是十天后动物仍然健康说明动物咬你时没有发作狂犬病不带毒？如果不是的话打了又有啥用。不过在我们国家。打免疫蛋白一般是确定被狂犬咬了才打的，感觉牛头不对马嘴啊？。如果仍然不能解除你困惑的话，打了狂犬疫苗有啥用呢。且不谈其中的产业利益。按照世界卫生组织的十日观察法，只要被狗或猫抓咬你去防疫站医生都让你打针的，楼主可以选择打针减轻心理压力。你狗没得狂犬
谢谢你的关注。你的信息对我很有帮助！碰到那个医生，他一开口说话 我就感觉他不好。（当时我真的给他说的话吓倒了），理智 的 思考 一下，觉得他是 夸大的。但毕竟他是医生，他的话 多多少少 会让我有点 想法（担忧）。所以我 才 写出来 听听 大家的 意见！我有个朋友 那天也是 被 狗咬伤，咬出血了，她自己清理了上伤口，然后去同一家医院，但不同的医生，也只叫她 打 狂犬病疫苗 就可以了。所以 我才困惑！
不是被狗咬就会得狂犬病的，生活中有很多人被狗咬伤抓伤，但你进防疫站医生肯定会让你打针，一方面是疫苗的利润，一方面是大家都有怕死的心理，还有就是现在的医生缺乏医德，都很不耐烦，有些地方防疫站的医务人员本身缺乏业务知识，还有被鸽子啄伤让别人打狂犬疫苗的可笑案例。在中国，大家的恐狂心理和不当的舆论宣传也有关系的，所以有的人没得狂犬病却吓成了恐狂神经症。
是的，你说的话 我赞同的。我前两天确实有点恐狂... ...(即使再次打了疫苗,但因为看到狗狗病的感觉它快死了，不开心，加上又想起那个 医生当时的话语，我就不由自主的 胡思乱想）。我也跟一个医生朋友提到这个事，他还笑话我：“他不吓你，你怎么会掏钱出来，不掏钱出来，他怎么攒钱”...这个问题，医德，始终觉得中医 好点！公立医院 的西医/医生 连多问两句 都有可能 挨骂！ 长知识了 看了 祖述宪教授的新浪博客，谢！
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这种情况没有必要打狂犬病人免疫球蛋白！并且至今还没有明显的病例表示犬瘟热会传染给人！伤口碰到宠物犬唾液要及时去冲洗消毒就没事！
需要 伤口接触唾液属于Ⅲ级暴露 按规范是需要打免疫球蛋白的 而且要在首针疫苗接种7天内（含7天）打
这个课不能马虎的
瓦尼以后有什么后遗症
不过就是有点贵
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