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淘豆网网友近日为您收集整理了关于PDF-实时荧光定量PCR检测+HBV+DNA的线性范围与最低检出限的验证的文档，希望对您的工作和学习有所帮助。以下是文档介绍：PDF-实时荧光定量PCR检测+HBV+DNA的线性范围与最低检出限的验证 作者简介:张运洪,男,主管检验技师,主要从事临床免疫及分子诊断研究。检验技术与方法实时荧光定量PCR 检测 HBVDNA 的线性范围与最低检出限的验证张运洪,秦维超,何玲,黄建军(重庆市江津区中心医院检验科,重庆 402260)
摘要:目的试用实时荧光定量 PCR 定量检测乙型肝炎病毒核酸(HBVDNA),求出其线性范围与最低检出限,从而对本实验室检测 HBVDNA 的主要性能进行验证。方法参照相关的文件,通过系列稀释高浓度标本得到超过厂家申明线性范围的系列浓度标本,进行线性范围的验证;通过系列稀释低浓度标本得到超过厂家申明最低检出限的系列浓度标本,进行最低检出限的验证。结果 HBVDNA 检测的线性范围为8.58×102~8.41×107IU/mL,最低检出限为4.07×102IU/mL。结论实时荧光定量 PCR 检测 HBVDNA 的线性范围与最低检出限达到预期要求,检测方法和验证方案简便、可行。关键词:实时荧光定量聚合酶链反应; 乙型肝炎病毒核酸; 线性范围; 最低检出限犇(来源：淘豆网[/p-6592554.html])犗犐:10.3969/j.issn.4.17.041 文献标识码:A 文章编号:4)犞犲狉犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犾犻狀犲犪狉狉犪狀犵犲犪狀犱狋犺犲犿犻狀犻犿狌犿犱犲狋犲犮狋犻狅狀犾犻犿犻狋犻狀狉犲犪犾狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲狇狌犪狀狋犻狋犪狋犻狏犲犘犆犚犳狅狉犎犅犞犇犖犃犣犺犪狀犵犢狌狀犺狅狀犵,犙犻狀犠犲犻犮犺犪狅,犎犲犔犻狀犵,犎狌犪狀犵犑犻犪狀犼狌狀(犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犆犾犻狀犻犮犪犾犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔,犑犻犪狀犵犼犻狀犆犲狀狋犲狉犎狅狊狆犻狋犪犾,犆犺狅狀犵狇犻狀犵402260,犆犺犻狀犪)犃犫狊狋狉犪犮狋:犗犫犼犲犮狋犻狏犲 Userealtimefluorescencequantitativepolymerasechainreaction(PCR)todetermine HBV DNA,thencalculatethelinearrangeandtheminimumdetectionlimit,w(来源：淘豆网[/p-6592554.html])hicharethemainperformanceindicatorsinthelaboratoryverification.犕犲狋犺狅犱狊 Accordingtotherelateddocuments,byserialdilutionofhighconcentrationsamples,samplesofserialconcentrationswereobtainedwhichwereoutofthelinearrangementionedintheinstructions,thenverifidthenewlinearrange.Byserialdilutionoflowconcentration,sampleswereobtained,theconcentrationsofwhichwerelowerthantheminimumdetectionlimitofprovidebythemanufacturer,thenthenewminimumdetectionlimitwasverifi(来源：淘豆网[/p-6592554.html])ed.犚犲狊狌犾狋狊 ThelinearrangeofHBVDNAdetectionwas8.58×102-8.41×107IU/mL,andtheminimumdetectionlimitofHBV DNAdetectionwas4.07×102IU/mL.犆狅狀犮犾狌狊犻狅狀 ThelinearrangeandtheminimumdetectionlimitofRealtimefluorescencequantitativePCRassessedreachestheexpectedrequirement,andthemethodandvalidationschemearesimpleandfeasible.犓犲狔狑狅狉犱狊:realtimefluorescencequantitativepol DNA,hepatitisB minimumdetectionlimit
在本科室的实(来源：淘豆网[/p-6592554.html])际工作中使用实时荧光定量 PCR 进行乙型肝炎病毒(HBV)DNA 检测的精密度、准确度,能长期、稳定地控制在理想水平。各水平室内质控和各级室间质评都能很好反应本实验室的精密度和准确度。另外,HBVDNA 检测的线性范围与最低检出限也是重要的性能指标。新型抗 HBV 药物的使用对 HBVDNA 检测的线性范围与最低检出限都提出了更高要求[13]。现有检测 HBV DNA 的商品化试剂也在不断改进,以适应临床需求。因此,实验室现用的 HBV DNA 检测系统的性能指标,特别是线性范围与最低检出限需要重新进行评估。根据美国病理家协会(CAP)和ISO15189对医学实验室的质量和能力的要求[4],参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)相关文件,笔者对本科室的 HBV DNA 检测系统的线性范围与最低检出限进行了评估。1 材料与方法1.1 标本来源来源于本院进行治疗的乙型肝炎患者送检的新鲜血清。1.2 仪器与试剂罗氏 LightCycler480Ⅱ型实时荧光定量PCR 仪、博日 HB202型恒温金(来源：淘豆网[/p-6592554.html])属浴、飞鸽 TGL16G 型高速离心机。试剂、标准品均为凯杰生物工程(深圳)有限公司产品,HBVDNA 检测试剂批号为,HBVDNA 标准品批号为。HBVDNA 室内质控品购自北京康彻思坦公司,该质控品可溯源至 GBW(E)090137,具有低水平 HBVDNA 浓度。1.3 方法1.3.1 线性范围参照 EP6A 文件[5],选取 HBVDNA 浓度大于1.00×108IU/mL 的高浓度的新鲜血清标本,用 HBVDNA 阴性的标本进行系列稀释,稀释倍数分别为 1.00×10、5.00×10、1.00×102、5.00×102、1.00×103、5.00×103、1.00×104、5.00×104、1.00×105、5.00×105,包括原倍标本共 11个样本,每个样本重复测定3次取均值。首先要求试验有效且室内质控结果在控,然后将实测值与理论值(来源：淘豆网[/p-6592554.html])进行比较。以经对数处理的实测值为犢,经对数处理的理论值为犡,计算回归方程:犢=a犡+b,要求相关系数狉&0.975或狉2&0.95,斜率a在0.97~1.03范围内,截距b与最高浓度比较接近0。1.3.2 最低检出限
借鉴 EP17A 文件[6],选取 HBV DNA浓度为1.00×103~1.00×104IU/mL 的低浓度新鲜血清标本,进行系列稀释,稀释至低于 5.00×102IU/mL。每个稀释样本重复检测10次。在最低检出限上的水平,应每个样本都能检出。反之,在每个稀释度10个重复检测中有任意1个或者1个以上不能检出,则说明低于了最低检出限的水平。同时2632 国际检验医学杂志2014年9月第35卷第17期 IntJLabMed,September2014,Vol.35,No.17要求实验有效且室内质控结果在控。2 结 果2.1 线性范围线性范围评价试验结果见表1。根据表1中数据绘制的线性散点图,见图1。回归方程各参数(狉2、a、b)都未超过(来源：淘豆网[/p-6592554.html])要求的水平,这表明在以下范围内线性良好:8.58×102~8.41×107IU/mL。这略宽于厂家提供的线性范围(1.00×103~5.00×107IU/mL)。该范围也是本实验室的可报告范围,同时该范围能满足临床需要。表1
线性范围评价试验结果理论值浓度(IU/mL) 浓度对数实测值浓度(IU/mL) 浓度对数1.67×.60××.41××.65××.91××.96××.07××.99××.97×10(来源：淘豆网[/p-6592554.html])44.781.67×.94××.91××.81××.58×
线性散点图2.2 最低检出限以原倍血清(HBVDNA 浓度为2.04×103IU/mL)稀释后进行试验的结果见附表1(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。按1.3.2的方法确定最低检出限为4.07×102IU/mL,略低于厂家提供的5.00×102IU/mL 的水平。3 讨 论PCR 检测 HBV DNA 的试剂或仪器不一样,性能指标也会不同[78]。某检测系统临床应用前,需要掌握该检测系统的性能指标。这些性能指标通常生产厂商已提供,但是在临床应用前,实验室仍需对生产厂商提供的方法学主要性能予以验证并确认。临床实验室要结合实际,合理选择方法学验证试验,系统设计方(来源：淘豆网[/p-6592554.html])法学验证方案[9]。PCR 检测项目较为特殊,相比于其他专业检测项目,其检测原理特别,检测过程繁琐,有大量的手工操作,某些项目阳性标本稀缺,标准物质来源困难,检测成本高等,并且在多年前有较多实验室未经过验收就在开展临床检测。若按常规项目进行方法学验证要花费更大的人力物力。但是,仍需对 PCR 检测项目的方法学性能指标进行评价。评价的方法要结合本实验室的情况进行,要实际有效。临床基因扩增检测实验室通过多年的运行,分析某个PCR 检测项目的室内质控和室间质评数据,可以了解该项目精密度和准确度。本实验室每年都进行了 HBV DNA 室内质控和室间质评数据分析,都能达到预期要求,并且持续改进,不断提高。线性范围与最低检出限是目前PCR 检测 HBVDNA 最重要的性能指标,特别是在患者应用长效干扰素和新型核苷(酸)类似物后,HBVDNA 检测的线性范围越宽、最低检出限越低,就越利于其疗效监测[3]。对于多点校准的项目,一般不需要对线性范围进行验证。但是,本科室常使用的 HBV DNA 检测的校准品一般(来源：淘豆网[/p-6592554.html])都在1.00×104~1.00×107IU/mL的范围。在使用这些标准品绘制的标准曲线时,为了达到更宽的可报告范围,标准都进行了两端的延伸,达到1.00×103~1.00×108IU/mL。因此,有必要对线性范围进行验证。本课题组使用了经多次稀释定值的大于1.00×108IU/mL 患者标本进行系列稀释后检测,得出HBVDNA 检测线性范围略宽于厂家提供的线性范围,证明厂家提供的这一个性能指标在本室的检测系统上可用。取整后,仍采用厂家提供的1.00×103~5.00×107IU/mL作为本室的HBVDNA 检测线性范围。最低检出限是指能可靠检出分析物的最低实际浓度。EP17A 文件指出[6],验证常规项目的定量检出限要检测某一水平至少25次重复检测,每次重复检测的结果与该水平的参考值比较,计算超出目标误差的度量。结合本室实际情况,选取了 HBVDNA 浓度在1.00×103~1.00×104IU/mL的患者标本,进行系列稀释,稀释至低于厂家提供的最低检测限水平。每个稀释样本重复检测10次。在理论值为4.07×102IU/mL的稀释标本10次重复检测中,每次都能顺利检出,且10次检出值的犆犞较低(犆犞=3.31%),与本室低水平(约5×103IU/mL)室内质控的年变异系数相当。在理论值为8.14×10IU/mL的稀释标本10次重复检测中,有3个未能检出,且7次检出值的犆犞较高(犆犞=11.12%)。在某个浓度水平的10个重复检测中有任意1个或者1个以上不能检出,就说明该水平低于了最低检出限。很明显,4.07×102IU/mL就是本研究中求出的最低检出限,且略低厂家提供的5.00×102IU/mL的水平。取整后,本科室仍采用厂家提供的 5.00×102IU/mL作为 HBVDNA 检测的最低检出限。本研究中的 HBVDNA 检验结果报告单格式按上述评价验证进行设计:(1)当检测浓度结果大于 5.00×107IU/mL时,出具报告为“&5.00×107IU/mL”。若要得到进一步结果,要稀释后重测。稀释后的检测浓度结果要在标准品浓度最高值与最低值之间。(2)当检测浓度结果小于5.00×102IU/mL时,仅报告“&5.00×102IU/mL”,不报告具体的浓度数值,这个浓度数值仅供参考。(3)当检测浓度结果介于5.00×102IU/mL与5.00×107IU/mL 之间时(包括5.00×102IU/mL与5.00×107IU/mL),检测浓度结果数值直接报告。并且在报告单上标注了“最低检出限:5.00×102IU/mL”,以免误认为“&5.00×102IU/mL”是 HBVDNA检测的临床参考值。通过上述研究,证明了现行 PCR系统检测 HBVDNA 的线性范围与最低检出限达到预期要求,检测方法和验证方案简便、可行。
(下转第2366页)3632国际检验医学杂志2014年9月第35卷第17期 IntJLabMed,September2014,Vol.35,No.17病,其余 24例未确诊),此 97例患者 HBVDNA 阳性率仅为17.5%。本次试验71样本 HBVDNA 阳性率为 16.9% 与相关文献报道一致,肝功能阳性率为35.2%,但样本缺乏明确诊断资料,低水平 HBsAg的临床价值尚有待进一步探讨。参考文献[1] 方筠,张久春,陈健,等.乙型肝炎病毒表面抗原确认试验方法的建立[J].检验医学,):] 黄伟,杨培华,陈健,等.乙型肝炎病毒表面抗原确认试验的临床应用[J].检验医学,):] 岳希全,石宏,李迎.ELISA 法检测 HBsAg影响结果的重要因素的分析[J].中国实验诊断学,):] 车文英,谭延国.不同检测系统测定乙肝病毒表面抗原检测灵敏度的探讨[J].中外医学研究,):2021.[5] 李宁宁,杨继红.乙肝表面抗原 ELISA 试剂灵敏度变化的动态研究[J].湖北预防医学杂志,):21.[6] 王岚,沈立松.不同方法检测乙型肝炎血清学标志物的结果比较[J].检验医学,):] 中华人民共和国卫生部医政司编.全国临床检验操作规程[M].3版.南京:东南大学出版社,] 骆抗先.乙型肝炎的基础与临床[M].2版.北京:人民卫生出版社,.[9] 王蕾,刘华,王雯静,等.低水平乙型肝炎表面抗原的检测及其临床价值评估[J].微生物与感染,):912.[10]谭玉华,陈鲜关,卢顺舵,等.时间分辨荧光免疫分析法乙型肝炎血清标志物分析灵敏度的建立与分析[J].中国医学检验杂志,):228.[11]杨朝国,张玲英,许建.隐匿性乙型肝炎病毒感染者血清 HBsAg阴性原因探讨[J].四川省卫生管理干部学院学报,):]林国英,陈国良,周宁.低水平乙肝病毒表面抗原的结果分析[J].临床军医杂志,):116117.(收稿日期:)(上接第2363页)志谢:本研究得到了重庆医科大学附一院检验科张莉萍教授、重庆医科大学附二院检验科陈维贤副教授、重庆市长寿区人民医院检验科李泉主任技师的悉心指导。参考文献[1] 中华医学会肝病学分会,中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南(2010 年版)[J].中华肝脏病杂志,):1324.[2] 罗杰,赖菁,谢俊强,等.肝移植术后6年乙型肝炎复发的临床分析[J].中华临床感染病杂志,):3738.[3] 罗杰,李向永,吴元凯,等.国产试剂 HBV DNA 检测下限与核苷(酸)类似物停药后乙肝复发的分析[J].广东医学,):] 中国合格评定国家认可委员会.ISO15189 医学实验室质量和能力认可准则[S].北京:中国合格评定国家认可委员会,2008.[5] ClinicalandLaboratoryStandardsInstituteStandard.EP6A Evaluationofthelinearityofquantitativemeasurementprocedures:statisticalapprovedguideline[S].Wayne,PA,USA:CLSI,2003.[6] Clinicaland LaboratoryStandardsInstituteStandards.EP17AProtocolsfordeterminationoflimitsofdetectionandlimitsofquantitation:statisticalapprovedguideline[S].Wayne,PA,USA:CLSI,2004.[7] 吴斌,李彩东,李惠军,等.两种国产乙型肝炎病毒核酸定量试剂盒检测结果分析[J].国际检验医学杂志,):] 巢薇.比对两台荧光定量 PCR 仪检测 HBVDNA 结果一致性研究[J].国际检验医学杂志,):] 毕波,吕元.定量检测方法学性能验证的系统设计[J].中华检验医学杂志,):143145.(收稿日期:檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶殞殞殞殞)生物标志物助力感染性疾病临床诊疗近日,由中国医师协会急诊医师分会主办,罗氏诊断产品(上海)有限公司协办的“感染诊断新技术临床应用中国行2014”启动会暨专家研讨会在北京召开,由中国医师协会急诊医师分会会长、北京协和医院急诊科主任于学忠教授担任大会主席。与会国内权威急诊专家重点探讨了感染标志物降钙素原(PCT)与白细胞介素6(IL6)的临床应用价值。作为血清降钙素(CT)的前肽物质,PCT 在感染开始后最初3h即可测得,6~12h后可达最高峰值,与传统生物标志物相比,PCT 半衰期接近24h,且几乎不受肾功能状态、激素治疗的影响。独特的生物学特点,使 PCT 对机体感染的反映具有快速准确的特征,并被2008版《美国重症成人患者新发发热指南》等推荐用于指导临床感染治疗。动态监测 PCT 水平的变化趋势可以指导抗菌药物的合理应用,减少临床非必需抗菌药物的使用和重症监护室(ICU)的再感染率,减少脓毒症患者的住院时间,且对ICU 脓毒症患者死亡率与存活率有很好的预测作用。IL6具有调节免疫应答、急性期反应及造血功能的作用,在机体抗感染免疫反应中起重要作用,可作为有效的预测指标,在重症医学、急诊医学、早发型新生儿脓毒症、创伤危险分层和预后、术后风险等领域应用尤为突出。作为脓毒症预后的生物标志物,若入院时IL6&1000ng/mL,预示患者死亡高风险。此外,脓毒症是新生儿发病和死亡的主要原因之一,每1000名新生儿中就可能有1~10例发病。创伤患者和术后患者亦有发生脓毒症的风险,应用生物标志物检测有助于其诊断和预后。在实际操作中,PCT 联合IL6检测可以避免单一指标对感染类别判断的误差,及时帮助临床医师尽快确定患者的治疗方案,进而提高患者治疗成功率,具有重要的临床应用价值。“感染诊断新技术临床应用中国行2014”将覆盖全国10个省市,旨在通过与全国各地区急诊医师的学术研讨和互动交流,推进感染诊断技术在急诊感染领域的应用和发展,造福更多患者。6632 国际检验医学杂志2014年9月第35卷第17期 IntJLabMed,September2014,Vol.35,No.17播放器加载中，请稍候...
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OD（3.130）
S/CO（29.8）；2、表面抗体HBsAb 阴性-
OD（0.005）
S/CO（0.053）；3、E抗原HBeAg
OD（0.017）
S/CO(0.169);4、E抗体HBeAb
S/CO(0.019);5、核心抗体HBcAb 阳性+
OD（0.006）
S/CO（0.020）6、HBC-IgM
其它：1、谷丙转氨酶ALT 50.02、谷草转氨酶AST 34.03、AST:ALT 0.6804、总蛋白65.05、白蛋白40.76、球蛋白24.37、白球比例1.678、总胆红素16.89、直接胆红素4.710、间接胆红素12.1011、碱性磷酸酶65.012、r-谷氨酰转肽酶36.013、腺苷脱氨酶 13二、乙型肝炎病毒（HBV-DNA）定量检测结果实时荧光定量PCR结果： 1.78E+05，最低检测下限为：5.00E+02三、B超诊断报告如下：提示：1、肝实质回声增粗，肝内高回声；2、胆囊壁毛糙。检查所见：1、肝脏：左叶纵切38X58 mm2，右叶：肋下0mm，厚100mm，斜径138mm，肝轮廓 清，形态正常，包膜光，肝下缘角锐，肝内管系未见明显异常，肝内回声呈增粗、增强、于肝右前叶见一6X4mm略高回声；
肝外胆管内径4mm 门静脉主干内径13mm2、胆囊：纵切61X21 mm2，轮廓清，壁毛糙 囊内：未见明显异常3、胰腺：腺头14mm，腺体10mm，腺尾9mm，腺内回声均4、脾脏：厚30mm，肋下0mm，脾静脉内径（空白）mm5、肾脏：（空白、无文字）6、其它：（空白、无文字）急请教专家医生：1、我的病传染性强不强，会不会传染我的老婆孩子（我35岁，有个男孩、不到8岁），平时生活中需要注意些什么细节以免对她们造成传染或危害？谢谢！2、我的病严重吗？属于什么情况（详细确诊结果是什么？）？需要怎么治疗？大概花多少钱、花多少时间？谢谢！3、我平常的饮食起居需要注意些什么？有哪些是特别要严格遵守的？4、我这种情况的话严不严重？有没有生命危险？大概还能活多长时间？谢谢！请各位医生、专家给我详细说一下，再次表示感谢。谢谢您了！
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您现在的情况有一定的传染性，建议给妻子和孩子检查一下。乙肝这种疾病的传染方式主要是血液传播，母婴传播和性传播，平时的和家人的饮食用具要分开，性生活要做好防御措施，您自身禁食烟酒，辛辣刺激性食物等。关于疾病方面您现在的情况向肝功能损伤方面发展，如果不治疗或是治疗不规范，最后的结果是会发展到肝癌的。不过您也不用过于担心，早期规范治疗效果还是会很好的。治疗方面不能单纯的传统对症保肝护肝，抗病毒，应该从增强机体免疫力，激活免疫系统功能下手。
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你是乙肝小三阳，传染性小，但病情隐匿，随着年龄的增加容易发展，而且你现在肝功异常，病毒复制活跃，B超提示肝实质的受损，还有胆囊炎，建议及早治疗，但目前西医对乙肝没什么好的治疗方法，副作用大，停药容易反弹，建议及早中草药调理修复肝细胞，在你这个年龄用对了配方效果理想，平时注意休息，清淡饮食，不要喝酒熬夜，还有就是让家人打疫苗，在此愿你早日康复
不需要注意什么你这是定型了。你不惹它它就不惹你你的心情一定保持好就是了。放心它不会要了你的命的 而且你有见过得了乙肝死了的人吗？肝癌只是针对那些先天性的人而言的。
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实时荧光定量PCR
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想得到怎样的帮助：请问乙型肝炎病毒（HBV--DNA）定量单怎么看呢？（感谢医生为我快速解答——该。）
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病情分析：HBV--DNA主要是看乙肝病毒的复制情况，也就是说是不是乙肝处于活动期，以及传染性强弱的问题。指导意见：从你提供的数据来看，乙肝病毒复制比较活跃，处于活动期，传染性较强
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病情分析：你好，你的乙肝病毒定量检查结果是9.82乘10的2次方，而正常值是小于5乘10的2次方，你的检查结果比正常值略高一些。指导意见：肝功能检查是正常的，那么目前是不用进行治疗的，只要定期检查观察就行，平时注意生活起居要有规律，饮食以清淡易消化为主，忌酒，适当活动，不要劳累，慎用有肝肾损害的药物。
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病情分析：9.82E+02即982IU/ml，稍高于检测下限。指导意见：如果乙肝病毒控制良好的话，应该低于检测下限，你现在稍稍高于检测下限，不过问题不大，可以不用抗病毒治疗，由于肝功能结果正常，也不需要保肝治疗，注意休息，定期复查即可。
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病情分析：你好 乙肝病毒的dna、定量就是 最低检测下限5.00E+02 就是说是500左右
你的结果9.82E+02
比正常值是高些的
是982 指导意见：这个目前考虑还是低复制的 可以暂时不用抗病毒的药物 继续检测肝功 不用使用肝损害的药物 注意休息 就是可以的了
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