ELISA法检测牛奶中氯霉素残留的前处理方法_百度文库
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3秒自动关闭窗口海洋霉菌产抗癌药物灰绿霉素A合成相关的聚酮合酶基因的克隆及功能分析--《华东理工大学》2014年硕士论文
海洋霉菌产抗癌药物灰绿霉素A合成相关的聚酮合酶基因的克隆及功能分析
【摘要】：灰绿霉素A是由海洋灰绿曲霉(Aspergillus glaucus HB1-19, CCTCC M206022)合成的真菌聚酮类次级代谢产物,为首次发现的新型蒽醌衍生物。作为一种新活性的天然产物,它对人体多种癌细胞增殖有抑制作用。灰绿霉素A还是研制后续系列新药产品的重要先导物,供进一步结构改造和优化。但灰绿霉素A在原始菌株中产量极其微小,制约了对它的体内活性评价和构效研究。前期的酶抑制剂法、前体喂养法以及同位素标记实验表明,该化合物通过聚酮途径生成。本文旨在对灰绿霉素A合成相关的聚酮合酶基因进行克隆和功能分析,为灰绿霉素A合成调控提供参考。
根据灰绿霉素A的合成途径分析,推断其由真菌I型非还原聚酮合酶(Polyketide synthetase, PKS)催化合成。本文首先使用简并引物LC1/LC2c克隆得到灰绿曲霉中非还原型PKS (NR-PKS)的基因片段,通过Genome walking获取22.8kb长度的基因序列,预测包括7条完整的基因,其中NR-PKS基因序列长度为8451bp,将得到的新NR-PKS基因命名为Agpksl。,通过构建KS-AT双交换缺失质粒,以博莱霉素抗性基因Sh ble作为筛选标记,筛选得到\AgKS-AT缺失株。对\AgKS-AT缺失株发育及表观形态分析：△AgKS-AT缺失株的分生孢子数稍高于野生株,但其子囊果数却高于野生株近8倍；在PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基上培养时,灰绿曲霉野生株呈灰绿色,△AgKS-AT缺失株呈淡黄色,且△AgKS-AT缺失株生长略快于野生株；扫描电镜结果,△AgKS-AT缺失株分生孢子色素附着胞较少,分生孢子头形态干扁且不规整,说明△AgKS-AT极可能缺失了合成色素的能力。在液体发酵的过程中,△AgKS-AT缺失株与野生株相比,菌体生长无明显差异,发酵液颜色较野生株浅。△AgKS-AT缺失株灰绿霉素A产量与野生株相比从78mg/L降到9mg/L,下降了88%,灰绿霉素A合成过程中的关键中间体Catenarin含量也从野生株的240mg/L降到140mg/L,下降了41.7%,表明Agpksl与灰绿霉素A合成相关。
【关键词】：
【学位授予单位】：华东理工大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2014【分类号】：Q789;R914【目录】：
摘要5-6Abstract6-10第1章 文献综述10-22 1.1 聚酮及聚酮合酶10-14
1.1.1 聚酮化合物的多样性及其药用价值10
1.1.2 聚酮合酶10-14 1.2 真菌PKS14-18
1.2.1 真菌PKS的克隆及鉴定14-15
1.2.2 真菌PKS的功能分析15-16
1.2.3 真菌PKS的异源表达16-18 1.3 PKS-NRPS数据库简介18-19 1.4 本课题的研究内容和意义19-22
1.4.1 灰绿霉素A合成相关的聚酮合酶基因的克隆及功能鉴定19-22第2章 灰绿霉素A合成相关的PKS基因的克隆鉴定及序列分析22-32 2.1 前言22 2.2 实验材料22-23
2.2.1 菌株及质粒22
2.2.2 实验所用试剂及试剂盒22
2.2.3 主要培养基22-23 2.3 实验方法23-25
2.3.1 基因组提取23
2.3.2 灰绿曲霉PKS基因简并引物的设计23
2.3.3 染色体步移23-25
2.3.4 灰绿曲霉RNA抽提及残留DNA的去除25 2.4 实验结果与讨论25-31
2.4.1 灰绿霉素A合成相关的聚酮合酶基因的简并引物设计25
2.4.2 NR-PKS与PR-PKS基因片段25-26
2.4.3 Genome Walking扩增灰绿曲霉PKS序列26-30
2.4.4 Agpks1进化树的构建30-31 2.5 小结31-32第3章 灰绿曲霉(HB1-19、)中△AgKS-AT菌株构建32-42 3.1 前言32 3.2 实验材料32-33
3.2.1 实验试剂32
3.2.2 培养基32
3.2.3 菌株培养条件32-33 3.3 实验方法33-38
3.3.1 引物设计及PCR反应33-34
3.3.2 灰绿曲霉原生质体的制备及转化方法34-35
3.3.3 AgKS-AT、AgACP-TE和Agpks1敲除质粒的构建35-38 3.4 实验结果与讨论38-41
3.4.1 △AgKS-AT,△AgACP-TE和△Agpks1敲除质粒38-40
3.4.2 △AgKS-AT转化子验证40-41 3.5 小结41-42第4章 △AgKS-AT缺失株表观形态及无性生殖分析42-49 4.1 前言42 4.2 实验材料42 4.3 实验方法42-43
4.3.1 △AgKS-AT缺失株菌丝形态的观察42
4.3.2 缺失株菌落直径测定42
4.3.3 子囊果及分生孢子计数42-43 4.4 实验结果与讨论43-48
4.4.1 灰绿曲霉中缺失AgKS-AT基因对其发育的影响43-44
4.4.2 缺失株与野生株表型比较44
4.4.3 △AgKS-AT缺失株菌落直径44-45
4.4.4 立体显微镜及扫描电镜分析△AgKS-AT缺失株分生孢子头45-47
4.4.5 发酵液颜色的对比47-48
4.4.6 △AgKS-AT缺失株的pH值和菌体干重48 4.5 小结48-49第5章 Agpks1基因的功能鉴定49-59 5.1 前言49 5.2 实验材料和方法49-52
5.2.1 实验材料49
5.2.2 灰绿霉素A测定49-50
5.2.3 Catenarin的测定50-52 5.3 结果与讨论52-58
5.3.1 灰绿曲霉野生株和△AgKS-AT代谢产物的鉴定52-56
5.3.2 不同时间段灰绿霉A和Catenarin含量对比56
5.3.3 灰绿霉素A生源合成途径的推导56-58 5.4 小结58-59第6章 结论与展望59-62 6.1 主要结论59-60 6.2 创新点60 6.3 展望60-62参考文献62-67致谢67
欢迎：、、)
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