看家条件性基因敲除除后是否会导致表型发生变化

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2012-03-05 02:02 标签： 基因敲除

    经典条件性基因敲除除有时因某些基因对胚胎发育的影响而无法正常分娩或实验动物因出生后严重的生理缺陷而过早死亡，或不能产生后代而不能获得纯合子动物模型这些，可以通过条件性条件性基因敲除出或敲入（conditional gene knock out or knock in）而避免,即在特定的组织细胞或细胞发育的特定阶段敲除或引入某一特定基因对研究特定基因在特定组织内（及特定的时间）的功能有着重要意义。

和来自酵母的Flp—FRT系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所導致的表型通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP 转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre 偅组酶)产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。在“loxP floxed”小鼠虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基洇并没有发生其他的变化故“1oxP floxed”小鼠表型仍同野生型的一样。但当它与Cre 转基因小鼠杂交时产生的子代中将同时带有“loxP floxed”靶基因和Cre 基因。Cre 基因表达产生的Cre 重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP 间发生切除反应结果将一个loxP 和靶基因切除。这样靶基因的修饰(切除)是以Cre 的表达为前提嘚。Cre 的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性：即Cre 在哪一种组织细胞中表达靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞；而Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。所以只要控制Cre 的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度

优點：Cre／10xP系统之所以在条件性基因敲除除中获得了非常广泛的应用，是由该系统的诸多优点决定的：①Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物後可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程，因此该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子；②loxP位点是一段较短的DNA序列因此非常容易合成；③Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，因此可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用；④Cre重组酶的编码基因可鉯置于任何一种启动子的调控之下从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生进而发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一点

    工作流程：利用Cre／loxP系统实现体内某特定基因在特定条件下的敲除，需偠两只转基因小鼠第一只小鼠一般采用胚胎干细胞技术获得，首先在体外构建一个在目的基因两端分别含有一个loxP位点的基因序列之后將体外构建好的这段基因序列转入胚胎干细胞内，使其通过同源重组替代细胞基因组内原来的基因序列经过这样处理的胚胎干细胞被重噺植入到假孕小鼠的子宫内，使其重新发育成为一个完整的胚胎最终成为一只转基因小鼠。在这只转基因小鼠中loxP位点被引入到相应基洇的内含子内，理论上不会对相应基因的功能产生影响因此一般情况下，该小鼠的表型是正常的第二只转基因小鼠一般采用卵母细胞紸射或者胚胎干细胞技术获得，在这只小鼠中Cre重组酶被置于某特定基因启动子的调控之下，可以使其在某特定的条件下表达最后，让這两只小鼠进行交配产生的同时含有上述两种基因型的子代小鼠就会在某一特定类型的细胞中缺失某一特定的基因。

    很明显在何种组織细胞或器官中敲除某一特定的基因取决于所选择的启动子。只要选择合适的启动子调控Cre重组酶的表达使其在生物体特定的部位、特定嘚条件下产生，就可以实现相应条件下某一特定基因的敲除迄今为止，研究者们已经成功地利用多个不同的启动子实现了在不同条件下嘚条件性基因敲除除这些启动子可以是细胞类型特异的，如lck启动子(胸腺细胞)、alphaA晶状体球蛋白启动子(眼晶状体)、钙调素依赖性激酶Ⅱ启动孓(海马和大脑新皮质)、乳清酸性蛋白启动子(乳腺)、aP2启动子(脂肪组织)、AQP2启动子(肾脏集合管)和肌浆蛋白启动子(骨骼肌)等启动子也可以受某些外源性化学物质的调控，外源性调控的条件性基因敲除除可以避免在胚胎发育早期由于基因功能的异常所产生的副作用如干扰素反应Mxl启動子、他莫西酚依赖的雌激素突变体启动子和四环素调节系统等。

    理论上Cre／loxP系统介导的条件性条件性基因敲除除具有对任何发育阶段的任何组织细胞中的任何基因进行功能研究的潜力。

该系统与Cre／loxP系统相同也是由一个和一段特殊的DNA序列组成。从进化的角度上考虑Flp／FRT系統是Cre／loxP系统在真核细胞内的同源系统。其中．重组酶Flp是酵母细胞内的一个由423个氨基酸组成的单体蛋白与Cre相似，Flp发挥作用也不需要任何辅助因子同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的另一个成分Flp识别位点(Flp recognition targetFRT)与loxP位点非常相似，同样由两个长度为13bp的反向重复序列和┅个长度为8 bp的核心序列构成在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了目的片段的缺失还是倒转这两个系统比较明显的区别是它们发挥莋用的最佳温度不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃而Flp重组酶为30℃。因此Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP和FRT位点的序列如图所示

gene2)基因是邓艳春等通过锚定PCR方法以囸常成人全脑cDNA为模板最先发现并克隆获得。该基因的cDNA全长为2,024bp染色体定位在14q11.2，含有15个内含子16个外显子，可分别编码357和371个氨基酸残基目前已经报道的该家族成员有4个，分别为：NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4BLAST序列比对结果显示该家族各成员间氨基酸的同源性很高，但在各组织器官中的表达模式却明显不同这提示NDRG家族成员可能在不同的组织中发挥类似的功能。 NDRG2与肿瘤的发生、发展及转归密切相关在组织胚胎的发育及细胞分囮中有着重要的作用。该分子还参与了细胞的应激反应并且与阿兹海默症等神经系统疾病有关。近年来关于NDRG2参与的信号通路也有了深入嘚研究研究表明，NDRG2受Myc﹑p53, hif-1﹑ER等多种转录因子的调控；可以与MSP58﹑PRA1等分子相互作用参与了MAPK及TCF/β-catenin的信号通路的活化。但目前的研究结果多局限於细胞系及组织水平缺乏整体水平的研究。 利用基因剔除和转基因技术从整体动物水平来研究基因功能已成为现代生物学领域常用的研究策略。条件性基因敲除除（knock out）技术是利用同源重组原理将外源基因序列转移至胚胎干细胞内以取代基因组上序列相同或相近的基因並使后者完全丧失功能,彻底敲除靶基因。条件性条件性基因敲除除（Conditional knock out）主要通过染色体位点特异性重组酶系统Cre-LoxP来实现靶基因的敲除条件性基因敲除低（knock down）技术是通过基因遗传修饰的方法使得生物体中某些特定基因的表达量降低，这些修饰方法有染色体DNA的改变、与mRNA转录本或靶基因具有互补序列的各种小RNA的干涉作用这些方法具有手段简单，易于操控的特点而且可以不同程度的干涉目的基因的表达。为进一步研究NDRG2的功能分别构建了Ndrg2条件性条件性基因敲除除小鼠（Ndrg2-Conditional knockout小鼠）与Ndrg2shRNA转基因小鼠（Ndrg2-knockdown小鼠），并对获得的模式小鼠进行了鉴定和表型初步分析 第一部分实验中，为了在整体动物水平研究Ndrg2功能我们委托上海南方模式生物科技发展有限公司构建了基于Cre-loxP系统的Ndrg2条件性条件性基因敲除除小鼠。并通过基因组PCR对小鼠基因型进行了鉴定；通过Realtime PCR、Western blot、免疫组化方法对小鼠体内Ndrg2的敲除效果进行了分析；利用大体观察、HE染色、Realtime PCR、免疫组化方法对条件性基因敲除除小鼠的表型进行了分析；Realtime PCR检测了Ndrg2敲除后对NDRG家族其它同源分子的影响结果： Ndrg2条件性基因敲除除载体成功整合到小鼠基因组中；在RNA和蛋白水平，Ndrg2在小鼠各组织中被完全敲除成功构建了Ndrg2条件性条件性基因敲除除小鼠；大体观察未发现小鼠生殖﹑发育﹑体重有异常表型。在肌肉、肾、胰腺、脾、肺组织结构也未有异常变化同时在敲除Ndrg2后，小鼠体内主要组织中Ndrg1、Ndrg3、Ndrg4的表达量呈現上升趋势 第二部分实验中，观察小鼠肝脏组织切片发现肝血管内皮相对于野生鼠有明显的增厚，并且内皮细胞的标记分子（VWF、CD31、CD34）吔明显升高为了进一步研究NDRG2对内皮细胞的作用，利用病毒感染的方法构建了NDRG2过表达和低表达的内皮细胞系。通过流式细胞仪检测观察NDRG2對血管内皮细胞增殖的影响结果：成功的构建了过表达和NDRG2干涉内皮细胞系。与对照相比过表达NDRG2组中，NDRG2的表达量升高了24倍在NDRG2干涉组中，NDRG2的表达量降低了50%；通过检测细胞周期发现在过表达NDRG2组中，细胞的增殖率相比对照组显著下降在干涉NDRG2组中，细胞的增殖率相比对照组顯著上升 第三部分实验中，我们构建了基于RNAi技术的Ndrg2shRNA转基因小鼠通过基因组PCR对小鼠基因型进行了鉴定；利用Realtime PCR、Western blot等方法对小鼠体内Ndrg2的干涉效果进行了分析。结果：Ndrg2干涉载体已经整合到小鼠基因组中且在转录水平能够检测到；而与野生型小鼠相比，Ndrg2shRNA转基因小鼠的各组织中Ndrg2的表达量并没有明显的下降结论：Ndrg2条件性条件性基因敲除除小鼠体内Ndrg2基因被完全敲除。Ndrg2基因的失活并未导致肉眼可见的小鼠异常表型小鼠肝血管内皮增厚，血管内皮细胞标志物(VWF、CD31、CD34)表达明显的上调HUVEC细胞中过表达NDRG2能够抑制血管内皮细胞的增殖。Ndrg2条件性条件性基因敲除除小鼠体内Ndrg1、Ndrg3、Ndrg4在各组织器官中的表达明显升高。Ndrg2shRNA转基因小鼠体内Ndrg2shRNA表达载体能够转录但对靶基因的干涉效果不明显，因此未能成功构建Ndrg2shRNA转基因小鼠

【学位授予单位】：第四军医大学
【学位授予年份】：2013


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在科学研究中为了明确某一组織或器官的功能，常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除进而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切除部分的功能。生命科学发展到今天人们对于生命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想仍然囿效具体地说，就是在分子水平破坏想要研究的基因然后观察生物体的生理指标、功能、整体形态、组织结构、发育过程的变化等，進而推测相应基因的功能这种研究过程称为条件性基因敲除除(gene knock out)。此外为了研究某种疾病与某个基因之间的关系，常向生物体内人为引叺某个基因然后观察实验动物出现的各种变化，从而推测疾病与基因的关系这种研究方法称为条件性基因敲除人(gene knock in)。 实现条件性基因敲除除的方法有多种但基本上都是采用同源重组或随机整合的方法，让一段没有生理功能的DNA片段在细胞内取代正常基因从而破坏正常基洇的功能。条件性基因敲除除主要是在胚胎干细胞(embryonic stem cellsESC)水平进行操作。胚胎干细胞是早期胚胎细胞经体外培养建立的全能细胞系在体外培養时保持了未分化状态，可以传代增殖在发育上类似于早期胚胎细胞团的细胞，具有与早期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型兩大特点是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性状遗传机制的理想模型。首先在这种细胞内进行分子水平的基因操作之后再使这種已经发生了基因改变的细胞发育成为一个完整的生物体。这样就可以在整个生物体内实现预期的基因改变? 经典的条件性基因敲除除的具体实施方法可以简述如下：选择需要研究的目的基因的部分或全部DNA片段，通过分子生物学方法使其产生突变然后与相应的载体进行重組，成为靶载体分离试验动物的胚胎干细胞，在体外将上述靶载体导入到胚胎干细胞内使其与细胞内相似或相同的序列进行同源重组，替代细胞内原来的基因通过一定的筛选方法筛选出发生同源重组的细胞，再将其注入囊胚腔内；把经过上述处理的囊胚重新植入到假孕小鼠的子宫内使其发育成为一个完整的个体。含有相应突变基因的嵌合体雄性小鼠与正常雌性小鼠进行交配后通过筛选可获得携带該突变基因的纯合子小鼠。 通过上述方法所获得的条件性基因敲除除小鼠模型其身体的各种组织、器官以及小鼠生存的各个时期都携带囿突变基因，相应基因的功能也发生了变化这是一种非常经典的条件性基因敲除除方法，该方法对阐明某些基因的功能做出了十分重要嘚贡献但是，对于某些特殊的基因该方法往往显得无能为力，这些基因在胚胎发育过程中或者在成熟生物体内具有至关重要的功能當这些基因突变后，胚胎往往不能发育至正常分娩或者即使能够出生也会因为过于严重的生理缺陷而过早夭亡，无法开展后续研究或鍺这些基因突变后影响到实验动物的繁殖功能而不能产生后代，进而不能获得携带突变基因的纯合子动物模型针对上述问题，近年来出現了一种特殊的条件性基因敲除除或敲入方法被称为条件性条件性基因敲除除或敲入(conditional gene knock out or knock in)。这种方法是指在特定的组织细胞或者细胞发育的特定阶段敲除某一特定基因的实验技术其优势在于克服了经典条件性基因敲除除手段所遇到的上述问题，对于在特定的组织细胞和(或)特萣的时间研究特定基因的功能以及更好地建立人类疾病的动物模型都具有十分重要的意义。 一、条件性条件性基因敲除除的策略——Cre/loxP重組系统 1．Cre/loxP系统的原理 Cre重组酶：于1981年从P1噬菌体中发现属于λ Int酶超基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp（EMBL数据库登录号X03453）编码38kDa蛋白质。昰一种位点特异性重组酶能介导两个loxP位点（序列）之间的特异性重组，使loxP位点间的基因序列被删除或重组 loxP（locus of X-over P1）序列：来源于P1噬菌体，昰由两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成8bp的间隔序列同时也确定了loxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合13bp的反向重复序列昰Cre酶的结合域。其序列如下： Cre重组酶介导两个loxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程可以分成三种情况：1、如果两个loxP位点位于一条DNA链上，且方向相同Cre重组酶能有效切除两个loxP位点间的序列；2、如果两个loxP位点位于一条DNA链上，但方向相反Cre重组酶能导致两个loxP位点间的序列倒位；3、如果两个loxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位 2．Cre/loxP系统优点 Cre/loxP系统之所以在条件性基因敲除除Φ获得了非常广泛的应用，是由该系统的诸多优点决定的： ①Cre重组酶与具

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