B珠蛋白基因41/42位点突变杂合子是什么意思?_百度作业帮
B珠蛋白基因41/42位点突变杂合子是什么意思?
是一种症状.那么,人一般的基因都有2个拷贝,一分来自母亲,另一份来自父亲.叫做等位基因.有时候2个基因会同时表达,所以体内有一半的蛋白正常,另一半不正常.若有此症,建议,β珠蛋白基因有一个拷贝上有点突变.这是基因的突变,无法根治.如果没有症状,不要治疗.有症状,则对症治疗.目前并不能确定有无风险,应进一步的检查明确下.望采纳,谢谢一种α_1珠蛋白基因突变异常血红蛋白G复合HbH（-α~(4.2)/SEA）病的研究--《暨南大学》2012年硕士论文
一种α_1珠蛋白基因突变异常血红蛋白G复合HbH（-α~(4.2)/SEA）病的研究
【摘要】：研究背景及目的
异常血红蛋白病(Abnormal hemoglobinopathies)属于常染色体显性遗传遗传疾病，珠蛋白肽链结构异常导致一种或一种以上结构异常的血红蛋白，部分或完全替代了正常的血红蛋白。肽链结构改变可导致血红蛋白功能和理化性质的变化或异常。结构异常可发生于任何一种珠蛋白链，但以β珠蛋白链受累为常见，异常血红蛋白病的蛋白表型均以其基因突变为基础。文献已报道的异常血红蛋白已达1021种，涉及不同的珠蛋白链。多数变种仅为携带者的遗传特性，少数变种则可引起临床症状从而影响患者的健康。血红蛋白G病（Hb G disease）属于异常血红蛋白病范围，于1954年由Edington和Lehamann第一次报导，其正常的血红蛋白为异常的血红蛋白完全或部分替代。血红蛋白G在过去的大规模血红蛋白普查中偶有发现，是一种少见的异常血红蛋白。目前已知HbG病主要是由于α链或β链异常所致，文献报道属α链异常的有HbGTaichung（常称HbQThailand）、HbGAudbaii和HbG Chinese等8种，属β链异常的有HbG Taipei、HbG Coushatta等14种。HbG病的发生与民族、地域有关，中国人以HbGTaichung、HbG Chinese、HbG Taipei和HbG Coushatta为主，HbGCoushatta以北方居多。多数异常血红蛋白G病无临床症状， HbG病分子异质性相当明显，包含多种类型的变异，通常按异常肽链一级结构分析进行分类。我国八、九十年代主要运用肽链氨基酸指纹图谱法进行氨基酸序列分析，目前国外常用高压液相色谱仪、毛细血管电泳等方法进行珠蛋白肽链分析鉴定异常血红蛋白类型。本课题通过血液学检查、高分辨琼脂糖凝胶电泳、珠蛋白α、β基因DNA测序的方法，对血红蛋白G病的血液学表现、分子生物学特点、珠蛋白基因突变进行分析，同时运用Gap-PCR法、反向斑点杂交法进行地中海贫血基因检测。确定本两例血红蛋白G基因突变类型，以及复合地中海贫血的分子基础。为异常血红蛋白G的临床、分子遗传学研究，提供更多的科学实验和理论依据。
材料与方法
患者王某某，女，41岁，广东珠海人。从幼年时期反复巩膜黄染，有胆囊炎、胆囊结石病史，体检发现巩膜轻度黄染，肝肋下未及、脾下缘在肋缘下约2cm。检查报告显示：血常规：Hb97.8g/L，MCV63.8fL，MCH18.8pg，MCHC295.0g/L；血液检查：血清铁42umol/L，谷丙转氨酶（ALT）60u/L,谷草转氨酶（AST）57U/L,总胆红素（TBIL）30.9umol/L，结合胆红素（DBIL）10.6umol/L，非结合胆红素（IBIL）20.3umol/L；血红蛋白琼脂糖凝胶电泳：血红蛋白A缺如，血红蛋白F2.0%，血红蛋白A_20.3%，血红蛋白G87.6%，血红蛋白H10.1%。红细胞脆性22.9%。
患者肖某某，女，32岁，广东韶关人。体检发现中度贫血貌，肝脾肋下未及，血常规：Hb84g/L，MCV61fL，MCH19.8pg，MCHC325g/L；血液检查：血清铁21umol/L，谷丙转氨酶（ALT）13u/L,谷草转氨酶（AST）26U/L,总胆红素（TBIL）13umol/L，结合胆红素（DBIL）6.4umol/L，非结合胆红素（IBIL）6.6umol/L；血红蛋白琼脂糖凝胶电泳：血红蛋白A缺如，血红蛋白F1.0%，血红蛋白A_20.5%，血红蛋白G81.0%，血红蛋白H17.5%。红细胞脆性7.9%。
血液学检验
红细胞参数分析采用雅培CD-3700全自动血细胞分析仪进行检测，血红蛋白电泳分析采用法国Sebia全自动电泳仪。血清铁、肝功能采用日立7170s全自动生化分析仪。
DNA基因分析
1.采用苯酚∶氯仿∶异戊醇法提取外周血DNA。
2.对α链和β珠蛋白基因进行DNA测序。
3.采用PCR和反向斑点杂交法检测地贫基因。
血液学分析结果
患者王某某，血常规表现为小细胞低色素贫血（Hb97.8g/L，MCV63.8fL，MCH18.8pg,MCHC295.0g/L），红细胞脆性为22.9%，较正常明显下降。琼脂糖凝胶电泳发现异常血红蛋白G87.6%，血红蛋白A缺如，血红蛋白A20.3%，血红蛋白H10.1%。。血清铁偏高42umol/L。谷丙转酶（ALT）60u/L,谷草转氨酶（AST）57U/L,总胆红素（TBIL）30.9umol/L，结合胆红素（DBIL）10.6umol/L，非结合胆红素（IBIL）20.3umol/L。
患者肖某某，血常规表现为小细胞低色素贫血（Hb84g/L，MCV61fL，MCH19.8pg,MCHC325g/L），红细胞脆性为7.9%，较正常明显下降。琼脂糖凝胶电泳发现异常血红蛋白G81.0%，血红蛋白A缺如，血红蛋白A20.5%，血红蛋白H17.5%。血清铁正常21umol/L。谷丙转氨酶（ALT）13u/L,谷草转氨酶（AST）26U/L,总胆红素（TBIL）13umol/L，结合胆红素（DBIL）6.4umol/L，非结合胆红素（IBIL）6.6umol/L。
DNA基因分析结果
采用苯酚：氯仿：异戊醇法提取两例患者外周血DNA，对α、β珠蛋白基因进行DNA测序，均发现α_1珠蛋白基因外显子2第128位G→C，密码子GAC→CAC，即α链N端的第74位天冬氨酸被组氨酸取代（Asp→His），为HbG Taichung（α_274Asp→His β_2）。α1的外显子1、3无异常。β珠蛋白基因外显子1、2和3均无异常。
对两患者DNA进行α地中海贫血SEA、3.7、4.2缺失基因分别进行PCR检测，均检出α地中海贫血SEA缺失杂合子和4.2缺失杂合子。对β地中海贫血基因突变位点：-29，-28、17、βE、41/42、43、71/72/654、Int、14/15、27/28、I-1、I-5、31采用反向斑点杂交(RBD)基因诊断未检出突变基因，发现两患者为中间型α地中海贫血HbH（--/-α~(4.2)）。
1.高分辨琼脂糖凝胶电泳是发现异常血红蛋白G的有效方法。电泳图谱表现出优势的血红蛋白G带并缺乏血红蛋白A带类型，可能是基因突变纯合子或杂合子同时复合地中海贫血基因突变，本两例经分子生物学分析证实为杂合子同时复合血红蛋白H(--/-α~(4.2))基因突变，提示血红蛋白G突变须作进一步DNA基因分析明确其突变类型。
2.分子生物学DNA测序，能准确检测出血红蛋白G基因突变，是确诊异常血红蛋白G类型的直接证据。
3. HbG Taichung是异常血红蛋白G的特殊类型，复合地中海贫血，引发临床症状。
4.血红蛋白G病是一组高度异质性疾病，其血液学、分子生物学、基因突变、临床特点具有多样性。
【关键词】：
【学位授予单位】：暨南大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012【分类号】：R55【目录】：
中文摘要3-7Abstract7-11目录11-13前言13-16实验材料及方法16-23 2.1 实验材料16-18
2.1.1 研究对象16
2.1.2 实验试剂16-17
2.1.3 主要仪器17-18 2.2 实验方法18-23
2.2.1 血液常规、生物化学检查及脆性试验19
2.2.2 琼脂糖凝胶电泳19
2.2.3 外周血 DNA 提取19-20
2.2.4 模板 DNA 的鉴定20
2.2.5 PCR 扩增及测序20-21
2.2.6 α地中海贫血基因检测21-22
2.2.7 β地中海贫血基因检测22-23实验结果23-34 3.1 实验室检查结果23-25 3.2 血红蛋白琼脂糖凝胶电泳结果25-27 3.3 α_1及其外显子的 PCR-琼脂糖凝胶电泳结果27-28 3.4 β珠蛋白基因外显子的 PCR-琼脂糖凝胶电果28-29 3.5 王某某α_1珠蛋白基因及α_1外显子 PCR 扩增产物提纯后 DNA 测序结果29-30 3.6 肖某某α_1珠蛋白基因及α_1外显子 PCR 扩增产物提纯后 DNA 测序结果30-31 3.7 β外显子 PCR 扩增产物提纯后 DNA 测序结果31-32 3.8 α地中海贫血基因检测结果32-33 3.9 β地中海贫血基因检测结果33-34讨论34-42 4.1. HbG 临床特点34-35 4.2 异常血红蛋白的分子结构和遗传基础35-36 4.3 血红蛋白 G 的发生特征36-37 4.4 血液学表现37 4.5 血红蛋白 G 的理化性质37-39 4.6 血红蛋 G 基因及遗传规律39-42结论42-43α和β珠蛋白基因结构图43-44中英文缩略词表44-45参考文献45-48综述48-53 参考文献51-53在校期间发表的论文53-54致谢54
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> α-地中海贫血的基因检测与诊断
α-地中海贫血的基因检测与诊断
　　国外医学遗传学分册2000年第23卷第3期
段山　李洪义（综述）　杜传书（审校）
　　摘　要
α-地中海贫血（α-地贫）是严重危害人类健康的遗传病，其基因背景正不断被揭示，具有遗传异质性。目前检测患者及其携带者的水平正不断提高。随着DNA分析技术的不断发展，α-地贫的基因诊断方法日臻完善。本文就α-地贫的基因的检测诊断的gap-PCR，M-PCR，PCR-ASO，ARMS，ACRS，DGGE，RDB，PCR-SSCP等方法进展作一综述。
　　关键词：α-地中海贫血　基因突变　基因诊断
　　α-地中海贫血（简称α-地贫）为累及全世界的高发病率遗传病[9]，具有高度遗传异质性，在不同人群中的发病率及类型差别很大。α-地贫[18]是由于α珠蛋白基因的缺失或功能障碍导致α珠蛋白肽链合成减少或不合成引起的，根据其分子缺陷分为基因片段的缺失型和非缺失型和非缺失点突变型两大类。其临床表型可从正常到需要反复输血，甚至危及生命。绝大多数α-地贫[19]是由于两相邻的α基因中的1个缺失（α-地2）或2个缺失（α-地1）造成的，即缺失型α-地贫。少数则是由于α株蛋白基因或其调节序列发生点突变、缺失或插入少数几个核苷酸造成。另外，某些结构异常的α珠蛋白肽链也能引起α-地贫。这种由点突变或点突变与缺失型突变共同形成的α-地贫称为非缺失型α-地贫。α-地贫传统的诊断方法[5]主要采用Hb电泳，等电聚焦，高效液相色谱分析和氨基酸测序等。另一类方法就是基因分析。随着DNA分析技术的不断发展，α-地贫的基因背景正不断被揭示，因而诊断该病患者及致病基因携带者的水平不断提高，从而对揭示其发病机理，有效监控此类疾病，提高人口素质有重要意义。现将其基因诊断方法的进展综述如下：
　　1 缺失型α-地中海贫血的基因诊断
　　1.1 Southern印迹杂交诊断
　　Southern杂交是早期使用的方法，由于它耗时、过程繁锁、不经济，不可能作为常规方法。然而由于其稳定性高，有些实验室中仍和其它方法结合使用。
　　1.2 对PCR为基础的诊断方法
　　以聚合酶链反应（PCR）为基础的各种新方法现已广泛应用于各型α-地贫的基因诊断，分别介绍如下：
　　1.2.1缺口PCR（gap-PCR）
　　此法是最常用的对缺失型突变的检测法，其原理之一为，在缺失区域内设计一对引物，由于4个α基因完全缺失（Barts’水肿胎），引物没有可互补的模板，故不能扩增出相应的PCR产物，但此法不能识别杂合子携带者。现在常用的另一方法是缺口连接PCR，其原理是，设计的引物和缺失序列的两侧翼序列互补，由于缺失两端相接，使本来在正常DNA序列中相距很远的这一对引物之间的距离，因断端连接而靠近，以至于能扩增出特定长度的片段。另外一对引物则设计位于缺失区域，这样仅在杂合子或完全正常的情况下，其中的正常等位基因才会扩增出来。此法可以检出大片段缺失的杂合子，如我国常见的α地1（东南亚型，即SEA型）。此法虽也可用于α3，7和α4，2两种α地2的检出[1，7]，但方法仍不稳定。因α1和α2基因中存在着大量同源序顺，对设计PCR引物造成困难。相对而言，α3，7的检测难度更大。Chang等[4]采用了突变特异性扩增（ARMS）法（详后）扩增特异性4.2kb片段，用扩建酶切点法（ACRS）来证实，据称可以检测合并有α4，2的所有α-地贫。
　　1.2.2 多重PCR（M-PCR）
　　多重PCR(multiplex PCR,M-PCR)R 原理为同时引入几对引物，使几个PCR得以在同一反应体系中完成。现已能用于同时诊断以下几种类型的突变：（--SEA）、（--MED）、-（α20，5）[2]或（--MED）（-α3，7）[3]或（-α3，7）、（α4，2）、（-MED）[13]等类型的α-地贫。
　　Bowden等[2]1992年报道了检测常见的严重α-地贫（--SEA）、（--MED）和（－α20，5）的方法，此法满足了下列要求：①所有所应均能在相同的反应体系中进行：②同时出现单个基因缺失（-α3，7和α4，2）不会干扰反应；③每种突变均有内、外对照。但引无此法还不能用于地中海地区的（-CAL）、（-SPAN）型和东南亚地区的（-FIL）和（-THAL）型。Oron-Karni等[13]报道的M-PCR方法能更快速的检测（-α3，7）、（αααanti3,7)、（-α4，2）、（-MED）等缺失型突变。分别设计4个PCR反应管。每个均能确定几种类型的这几突变相结合的杂合子，并通过分析4个PCR结果间的相互关系以确定单个PCR反应所不能确定的一些类型。最近Harteved等设计了[17]一系列简便、快速、可靠、非放射性的PCR技术，据称几乎可以检测所有缺失α-地贫。
　　2 非缺失型α-地中海贫血的基因诊断
　　2.1 PCR-酶解法
　　如突变产生或取消了一个限制性酶切点，用特异的限制酶切PCR产物，就能很容易地检测出某种突变。如Liu等[24]用MseI酶切法检出Hb cS。
　　2.2 扩建酶切点法（ACRS）
　　由于很多突变并不产生或取消限制性酶切点，Chang等[5]设计了一种称为扩建酶点法（ACRS）或更确切地称为错配酶切法(mismatched amplification restriction digestion)，并已成功地应用于HbCS的诊断。这种方法的关键是在引物的3’端，通过改变一个碱基创造或消除一个限制酶切点。Chang等最初用此法于G6PD基因的点突变检测。
　　2.3 PCR-ASO
　　聚合酶链反应结合寡核苷酸探针杂交（PCR-ASO）用ASO探针进行各种杂交[14]已广泛应用于检测基因突变和多态性。此法也曾用于点突变α-地贫的检测。
　　2.4 ARMS
　　突变特异性扩增（ARMS），直译放大受阻突变体系，又称为等位特异性PCR（AS-PCR）。其基本原理是，在一对引物之一的3’端设计一个碱基与突变碱基配对，这样，此引物由于3’端与正常DNA不配对而在PCR反应中不能延伸，突变的DNA则可以延伸。因而可将一段正常DNA与该段突变DNA分开。为增加其特异性，通常在离突变碱基2～3个碱基处增加1个错配碱基，使正常DNA有2个碱基与引物不配对。此方法具有快速、简便、非放射性等特点，得到广泛应用。在此基础上，针对不同点突变可设计多个错配引物，在一个反应体系中进行PCR反应，即多重等位基因特异PCR(multiplex allele-specific PCR)[15]该技术关键在于①如果5’端为共用引物，则3’端错配引物与共用引物间应有相当距离，才能辨认出不同突变；②调整各引物间的浓度和比例；③通过引物设计来统一退火温度和时间。
　　2.5 DGGE
　　变性梯度凝胶电泳（DGGE），能够检出基因组DNA中是否存在突变，但不能确定突变的位置和性质的准确信息，而这需由测序来完成。DGGE和PCR结合能使人类基因组中的DNA突变被确定于长约100bp的小片段中，可直接测序。DGGE还具“扫描”分析待测片段的优点，DNA扩增片段中任何小的序列变化（点突变、几个碱基的插入或缺失）均可检出。Harteved等[17]用DGGE结合单链构象分析（SSCA）成功检测了7种已知的导致α-地贫的突变。阐明了18个疑为非缺失型突变携带者的基因背景，并发现了两种新的突变和3个新的多态位点。但由于需要测序或“扫描”才能确定突变的性质和位置，并且对操作过程及条件有一定的要求，略显繁琐。
　　2.6 RDB
　　反向点杂交（RDB）检测点突变的原理和ASO法相同，但RDB是在膜上固定ASO探针而非固定靶DNA。这样，在一个杂交反应中便能同时分析一个标本中可有存在的多种点突变。杂交信号的检测现多采用非同位素方法。该技术关键是根据靶序列突变点的碱基结构特点，选择和调整ASO探针组成和长度，使各种固化ASO探针在杂交时具有尽可能一致的解链温度。Foglieta等[16]报道了用RDB法成功地检测了意大利人群中常见的非缺失型α-地贫。
　　2.7 PCR-SSCP
　　聚合酶链反应结合单链构象多态性分析（PCR-SSCP），其原理[22]为单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA的电泳迁移率不同，从而可用于DNA中单个碱基替代、微小插入或缺的检测。影响检测敏感性的因素有DNA片段的长度及其序列特性，另外还有温度、pH、离子强度和变性剂等因素。此法能快速灵敏地检测有无点突变或多态性。Alaya等[23]用三对引物分别扩增出α1珠蛋白基因及其侧翼区的三个片段。分别覆盖了该基因的3个外显子。然后进行SSCP检测。于1997年[18]首次在α-地贫患者的α1珠蛋白基因上发现了移码突变。但如欲阐明突变的性质，需作序列分析。此法多用于未知突变的检出。
　　作为一种具有高灵敏度的诊断遗传病的工具，PCR对操作人员和设备以及操作过程的要求较高，应特别注意其稳定性和准确性。如果仅仅只用PCR进行诊断，可能会有误诊的情况出现。Ko[11]在对α-地贫-1纯合子进行产前诊断时，发现了两种类型的误诊。第一种是由于PCR反应出现非特异性扩增导致假阴性或假阳性的结果。Smetanina等[12]设计的用于检测常见的α地贫-2的PCR方法也出现了类似的情况，干扰了-α3，7缺失型的检测，原因不明，最终通过设计新引物解决了此问题。第二种类型的误诊[11]是由于外源DNA的污染而造成的。特别是在产前诊断中会出现将纯合子与杂合子之间误诊的情况。这是由于产有诊断取材时，受母亲DNA污染所致，极低量的母亲DNA污染均可干扰得出正确结论。还有一些PCR受到污染的其他因素。因此，据PCR的使用现状很难避免误诊的产生，建议PCR应和其它一些诸如Southern杂交的方法结合使用，以使诊断结果准确无误。
　　近年，有些诊断α-地贫的其他方法，弥补了基因诊断某些方面的不足。如ELISA筛查，这种方法[20]现已可用于检测SEA缺失造成的α地贫-1携带者，并建立了用ELISA检测ζ珠蛋白链和用高效液相色谱仪检测Bart’s相结合的方法诊断SEA缺失造成的各种α-地贫。据称此法灵敏度高，特异性好。超声诊断[21，25]更是目前最易为病人接受，无创伤，最易普及的一种诊断Bart’s水肿胎的方法，实际上较晚时期水肿胎的检测已有被此法代替的趋势。超声波检测心胸比值和胎盘厚度可分辨孕期12周以后的正常与Bart’S水肿患儿，从而快速简便地作出诊断，并对孕妇无任何损伤。但由于水肿胎有多种原因引起，若需查明胎儿的基因型背景，仍需进行DNA分析。
　　Bowie等[3]报道了使用毛细管电泳技术诊断α-地贫的方法。它具有只需微量样品就可分析的特点，仅需10μl的全血样品或400ng提纯DNA样品即可进行分析，且比传统电泳具有更高的分辨率。Trent等[10]则报道了采用毛细管电泳一多色荧光ARMS法对α、β地贫进行基因诊断的方法。毛细管电泳据DNA片段的大小及所带电荷能将DNA片段在毛细管中电泳分离，其散热能力强，能在高电压下进行电泳，这大提高了这种技术的效力。和一般的电泳相比，其自动化程度高，微量样品仍可进行分析，所分离的产物在非常敏感的电导载体上清晰可见。由于使用不同的荧光染料标记引物，能通过不同颜色使迁移率相同的DNA片段被区分开。因此，毛细管电泳-多色荧光ARMS法使多重PCR能检测的突变种类大大增加。
　　3 结语
　　目前，缺失型α-地贫最可靠的诊断方法仍为传统的Southern杂交法，但其缺点显而易见。以PCR为基础的诊断方法使用范围广，缺失型和非缺失型α-地贫均可采用，显示出了巨大优势及潜能。目前用PCR法对α-地贫的产前基因诊断，还存在一定局限性。如样品的采集需对孕妇造成一定程度的损伤；样品采集过程中易受母血污染；目前的技术还不能进行更早期的基因诊断；基因诊断技术本身有很多环节还不太成熟，易产生假阳性或假阴性结果。从目前的发展趋势看α-地贫基因诊断需要发展一种或若干种快速、经济、准确、非放射性的方法。最近，人们在这几方面均取得了一定进展。Cheung等[6]报道了从母血中取样进行胎儿基因诊断的方法，即用磁力细胞将胎儿从母血中收集并用显微解剖的方法分离出纯胎儿细胞成功进行了β地贫的基因诊断，此方法同样适用于包括α-地贫在内的众多单基因病诊断。目前，植入前基因诊断[26]（PGD）用于多种遗传病诊断的研究正在展开，其中有的已获得初步成功。植入前基因诊断首先是从胚胎中（一般为8细胞期）获取1～2个细胞，由单基因组获得的DNA进行PCR扩增，使待检DNA的量能达到可检测多种突变的水平；然后用各种方法进行检测。目前难点主要在第一步，主要是污染，扩增效率低下和在单基因组DNA扩增中，一对等位基因中仅有其中一个基因成功扩增而导致对某些带有致病基因的杂合子胚胎漏诊allele dropout等问题。第二步检测现有的许多方法均可使用，如限制性酶切分析、连锁标记分析和SSCP等均已用于β地贫的植入前基因诊断。Chang等[8]报道了植入前诊断重型α-地贫的方法。他们分别从小鼠和人类的胚胎中吸取的分裂球中获取的DNA进行诊断，实验证明了从处于5个、7个、8个细胞期的分裂球中吸取一个或两个细胞（仅8细胞期），对胚胎的发展无影响。在小鼠和人的分裂球中检测到目标序列的机率为50%和76%。尽管此技术刚起步，在许多方面有待于改进。但此研究证明了对单基因遗传病进行植入前基因诊断的可行性，人类进行各种遗传病的早期诊断将成为可能。而Trent等[10]的毛细管电泳-多色荧光ARMS法重复性好，样品需要量极少，敏感性高，自动化程度高。以上研究均预示着基因诊断将来发展的方向。相信在不久的将来，α-地贫的基因诊断技术将更加成熟、完善。
　　作者简介：段山，男，1970年生，硕士，讲师
　　作者单位：中山医科大学医学遗传学教研室，广东 广州 510089
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