荧光定量PCR原理
荧光定量PCR原理
一、特点FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点。如一般PCR产物都需通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色紫外光观察结果或通过和银染检测，不仅需要多种仪器，而且费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的实验过程又给污染和假阳性提供了机会。而FQ-PCR只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCR后处理，避免了常规PCR操作中的诸多弊端。实验一般使用PE公司研制的ABI7100型PCR扩增仪。该仪器具有以下特点：①应用广泛：可用于DNA和RNA的PCR产物定量、基因表达研究、病原体检测及PCR条件的优化等。②独特的定量原理：采用荧光标记探针，经激光激发后荧光量随PCR循环而累积，从而达到定量目的。③工作效率高：内置9600型PCR扩增仪，电脑控制1～2小时全自动同步完成96个样品的扩增及定量。④无须凝胶电泳：无须对样品进行稀释和电泳，只须通过特殊探头在反应管内直接检测。⑤无管道内污染：采用独特全封闭反应管及光电传导系统，无须顾及污染。⑥结果重现性好：定量动态范围高达五个数量级。所以自从此项技术研制成功以来，受到许多科研工作者的重视并在多个领域得到应用。二、原理和方法FQ-PCR的是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光发射基因FAM（6-羧基荧光素，荧光发射峰值在518nm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA（6-羧基四甲基若丹明，荧光发射峰值在582nm处），探针的3’开端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动，当移动到探针切断，淬灭作用被解除，荧光信号释放出来（见图）。模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，因此用该技术可对模板进行准确定量。实验仪器一般使用PE公司研制的ABI7100型&PCR扩增仪，也可用其它PCR仪。如果用ABI7700型反应型反应系统进行实验，反应结束后，通过电脑分析，可直接给出定量结果。如果用其他PCR仪，则需要同时使用荧光探测仪测量反应管中的荧光信号，计算出RQ+、RQ-、△RQ。RQ+代表样品管荧光发射基团发光强度与淬灭基团发光强度的比率，RQ-代表空白管中二者的比率，△RQ（△RQ=RQ+-RQ-）代表PCR过程中荧光信号变化量，经过数据处理，即可得出定量结果。由于荧光探针的引入，显著提高了实验的特异性。探针设计一般应符合以下条件[2]：①探针长度应在20～40个碱基左右，以保证结合的特异性。②GC碱基含量在40%～60%，避免单核苷酸序列的重复。③避免与引物发生杂交或重叠。④探针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。
图.TaqMan&PCR反应模式&（A）聚合反应；（B）链置换；（C）裂解；&（D）聚合完成（R：FAM；Q：TAMRA，FP：上游引物；RP：下游引物）
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荧光定量PCR常用术语
来源:生物谷
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荧光定量PCR原理和过程已经非常清楚，为方便初学者更加清晰的学习，QIAGEN为大家汇总了荧光定量PCR常用术语，供您查阅参考使用。
基线：基线是早期循环的噪点水平，通常在第3和第15循环之间测量，这是因为在此期间还检测不到扩增产物引起的荧光值增加。用于计算基线的循环数量是可以改变的，如果使用高模板量或者靶标基因的表达水平高则循环数量需要减少。设置基线需要查看线性度扩增曲线的荧光数据。设置基线，使得扩增曲线的增长所开始的循环圈数大于基线循环最高圈数。对每个靶标序列都需要单独设置基线。早期循环检测到的平均荧光值需要从扩增产物中获得的荧光值中减去。各种real-timePCR软件的最新版本允许单个样品自动优化基线设置。
本底：是指反应中的非特异性荧光值，例如，低效率的荧光淬灭，或由于使用SYBR Green造成的大量双链DNA模板。信号的本底分量由real-time PCR软件算法数学除去。
报告基因信号 ：在real-time PCR过程中由SYBR Green或荧光标记的序列特异性探针产生的荧光信号。
归一化报告信号（RN）：这是报告染料荧光强度除以在每个循环中测量的被动参照染料的荧光强度。
被动参比染料 ：在某些real-time PCR中，荧光染料ROX被用作荧光信号标准化内部参照。它可以逐孔校正因校正因移液不准确、孔位置及荧光波动造成的变动。
阈值：阈值调整到本底值之上并显著低于扩增曲线的平稳值。它必须处于扩增曲线的线性区域内，代表了PCR检出的对数线性范围。阈值应在对数扩增曲线视图中进行设置，以使PCR的对数线性期易于识别。如果real-time PCR中有多个目标基因，阈值必须为每个目标进行设定。
循环阈值(CT)或交叉点（CP）：扩增曲线穿过阈值的循环（即，荧光检测值显著增加的点）。CT可以是一个分数，并且可以计算起始模板量。
ΔCT值： ΔCT值描述了靶标基因和相应的内参基因CT值的差值，例如看家基因，并用于标准化模板的使用量：
ΔCT = CT (靶标基因) C CT (内源性参比基因)
ΔΔCT值：ΔΔCT值描述了感兴趣样品（例如，刺激细胞）的平均ΔΔCT值与参考样本（例如，未刺激细胞）的平均ΔΔCT值之间的差值。参照样品也被称为校准样品，并且所有其它样品进行相对定量时都将被标准化到如此：
ΔΔCT = 平均ΔCT (感兴趣样品) C 平均ΔCT (参比样本)
内源性参比基因：e这种基因的表达水平在样品间不存在差异，例如看家基因(3)。对比内参基因与靶标基因的CT值可以将靶标基因的表达水平归一化到输入的RNA或cDNA的量（见上面关于ΔCT值部分）。反应中模板的确切数量不确定。内参基因对以下情况作出校正：可能的RNA降解或RNA样品中存在酶抑制剂的情况，以及RNA含量、逆转录效率、核酸回收和样品处理的变动。为了选出最优的参照基因（多个），我们对算法进行了改进，允许其选择依赖于实验设置最优参照（4）。
内参：在同一反应中被作为靶序列扩增的，并用不同的探针（即，进行双重PCR）检测的对照序列。内参经常被用来排除失败的扩增，例如没有检测到目标序列的情况。
标定样品：在相对定量中使用的参比样品（例如，源自细胞株或组织纯化的RNA），用以与所有其他样品进行比较，以确定某一基因的相对表达水平。标定样品可以是任何样品，但通常是一个对照品（例如，未处理的样品或来自实验零时的样品）。
阳性对照：使用已知量模板的对照反应。阳性对照通常用来检查引物集或引物C探针集工作是否正常，以及反应是否正确设置。
无模板对照（NTC）：包含除模板之外的所有扩增反应所必要组分的对照反应。这使得发现由于污染的试剂或外源DNA造成的污染成为可能，例如从以前的PCR中。
无RT对照： RNA制备物可能含有残留的基因组DNA，如果检测不被设计为仅检测和扩增RNA序列,其可以在real-time RT-PCR中进行检测。DNA污染可以通过操作在其中没有加入逆转录酶的RT对照反应来进行检测。
标准品：已知浓度或拷贝数，用于构建标准曲线的样品。
标准曲线：要生成标准曲线，CT值/不同标准稀释的交叉点对标准物质输入量的对数绘图。标准曲线通常是使用至少5种不同浓度的标准稀释倍比生成。每个标准曲线，应检查其有效性，斜率值落在C3.3到C3.8之间。标准是各浓度一式三份的理想测定值。标准曲线的斜率如果与这些值差异较大则应该舍弃。
效率和斜率：标准曲线的斜率提供了对real-time PCR的效率指示。斜率C3.322表示该PCR具有数值为1的效率，或100％的效率，并且PCR产物的量在每个循环增加到两倍。效率小于C3.322（例如，C3.8）则表示PCR的效率<1。通常，大多数扩增反应因为实验的限制不能达到100％的效率。斜率大于C3.322（例如，C3.0）表明PCR效率似乎是大于100％的。当在反应中的非线性期对值进行测量时可能发生这种情况，或者它可以指示是否有抑制剂存在。
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