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装甲RNA病毒样颗粒的制备及其在荧光PCR检测禽流感病毒中的应用
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采用随机PCR方法对临床标本中未知RNA病毒鉴定的研究
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采用随机PCR方法对临床标本中未知RNA病毒鉴定的研究
官方公共微信山东博思源生物技术有限公司
试剂盒简介:
&&& 深圳匹基生物工程有限公司开发的试剂盒采用RT－PCR荧光探针检测技术检测新型冠状病毒核酸RNA。选取新型冠状病毒的pol基因的两个保守区为靶区域，设计同时覆盖基因不同位点的两组特异性引物及荧光探针，扩增长度分别为192bp和151bp。两组引物和探针能与靶序列特异性结合，RT－PCR反应同时，荧光探针受激发的荧光信号可被全自动荧光PCR检测仪检测，实现RT－PCR反应的在线检测。
&&& 本试剂用于粪便和血浆样本中新型冠状病毒核酸RNA的定性检测，可适用于上述冠状病毒的辅助诊断。
&&& 试剂盒特点
&&& 高灵敏度:该试剂盒在香港卫生署公共卫生检测中心与欧盟已批准的商业化ＡＲＴＵＳ试剂进行比对试验结果显示，相关性达到93％，达到国际先进水平。
&&& 高特异性
&&& 防污染:该试剂盒无需PCR后处理，完全闭管扩增和检测，有效地防范了PCR扩增产物的污染，避免假阳性结果，提高临床诊断依据的可靠性。
&&& 操作简单、耗时短:试剂盒在特定的荧光PCR检测仪上进行扩增和检测，不需要进行电泳或杂交的操作，只需0.5－1.5小时（针对不同机型）即可完成PCR过程，有利于提高报告出具的速度。
&&& 适用面广:本试剂盒可对粪便和血浆样本进行检测。
&&& 结果客观可靠:无需人为判断，仪器自动收集和分析数据。
适用机型：PE5700；PE7000；MJ OpticonII；Roche LightCycler；ABI00；Roter-gene等
&&& 从2003年发现第一例SARS病例到现在，SARS涉及到世界近30个国家和地区，全球患者已达几千例。为此世界卫生组织（World Health Organization，WHO）迅速建立起由全球10个国家的13个实验室组成的协作研究和监测网络。研究发现，一种新型的冠状病毒极可能是病因，但也有可能有其他协同因素如hMPV（human metapneumovirus）使病情恶化，在香港和加拿大的病人和死亡病人的尸体中都分离出了这种病毒，在一些SARS病人的血清中也发现了抗hMPV的抗体。日WHO确认新型冠状病毒是我国称为非典型肺炎的严重急性呼吸综合征（Severe Acute Respiratory Sydrome，SARS）的病原体。
&&& SARS病毒是冠状病毒家族的一个成员，是引起严重急性呼吸综合征（ＳＡＲＳ，即非典型肺炎）的主要病原体，它是一种具有高度传染性的RNA病毒,这种新型的冠状病毒与冠状病毒属中其他已知的成员不同。冠状病毒是球形的、有包膜的病毒，可感染许多哺乳动物和鸟类。它拥有4种关键的结构蛋白：膜（M）蛋白，小包膜（E）蛋白，突出（S）糖蛋白以及核壳体（N）蛋白。N蛋白将RNA基因组包裹成一个核壳体，其外部被含有S，M，E蛋白的脂膜所围绕。M、E蛋白对于病毒的包膜结构是必不可少的。S蛋白的三聚体组成了病毒脂膜的特殊突起，该突起可与宿主细胞受体连接并使感染细胞融合。冠状病毒的基因组是由3万个碱基组成的具有感染性的正链RNA，是已知的RNA病毒中最大的。基因组的前三分之二中有2个开放阅读框（ORF）1a和1b，编码两组负责转录和转译的蛋白质聚合体。ORF 1b的下游是一些编码结构和几种非结构蛋白的基因。已知的冠状病毒可根据其基因组的相似性分入3个组中。组1包括：猪传染性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性肠炎病毒（TGEV）、犬科冠状病毒（CCV）、猫科传染性腹膜炎病毒（FIPV）以及人冠状病毒229E（HuCV229E）；组2包括：禽传染性支气管炎病毒（AIBV）和火鸡冠状病毒；组3包括：鼠肝炎病毒（MHV），牛冠状病毒（BCV），人冠状病毒DC43，鼠涎管泪腺炎病毒，猪凝血性脊髓炎病毒。
&&& 目前美国（CDC，USA）和加拿大（BCCA Genome Sciences Centre, British Columbia Centre for Disease Control and National Microbiology Laboratory Canada）的实验室完成SARS病毒的基因组测序。比较二者已经公开的病毒全基因组序列，发现有很小的差异。美国Urbani株长度为29，727 nt，其5ˊ端多出一段TTATTAGGTTTTTAC（15nt）；加拿大病毒株长度为29，736nt，其3ˊ端多出24个A。相对于Urbani株，加拿大病毒株其他位置的差别依次为：
&&& 7919（T&C），16622（T&G），19064（G&A），19183（C&T），20596（A&G），20910（G&T），23220（T&G），24872（C&T），26857（C&T）。
&&& 除了这些差别，SARS病毒基因组与其他冠状病毒的结构相似。初步的基因组注释在NCBI完成，预测得到的主要蛋白质有RNA聚合酶蛋白（聚合酶1a, 1b），S蛋白（spike protein），E蛋白（small membrane protein），N蛋白（nucleocapsid protein）等。
96%感染SARS病毒的人能够自愈。病毒在从SARS自愈的人的血清中生长缓慢，说明人体可以针对病毒产生抗体。SARS病毒为正链的单链RNA病毒，复制不经过DNA中间体，使用标准密码子。SARS病人的呼吸道切片和细胞培养物的电子显微镜照片显示，冠状颗粒；SARS病毒可以和I群冠状病毒的多克隆抗体发生反应；病毒引起VERO和FRhk-4细胞病变效应，病毒复制被SARS康复人的血清所抑制。&&&
SARS病毒主要经过紧密接触传播，以近距离飞沫传播为主，也可通过手接触呼吸道分泌物，经口鼻眼传播，另有研究发现存在粪-口传播的可能。是否还有其他传播途径尚不清楚。SARS起病急、传播快，病死率高，暂无特效药。与其他传染病一样，SARS的流行必须具备三个条件，即传染源、传播途径和易感人群，统称流行过程三环节。只有三个环节共同存在，而且在一定的自然因素和社会因素联合作用下，才能形成流行过程。如采取有效措施，切断其中任一环节，其流行过程即告终止。隔离与防护是目前最好的防护措施。
&检测SARS病毒的方法：
&&&& 现有诊断手段有3种，样品处理须在3级生物安全的条件下进行，病毒培养和动物试验需要在3+级的条件下进行：
&&& 1.抗体检测：ELISA（IGM/IGA）方法可以可靠地检出出现临床症状20天后SARS病人血清中的病毒抗体。某些病人在14-21天时，已经可以检测到抗体。免疫荧光法检测可以检测出病毒感染VERO细胞10天后产生的 M免疫球蛋白；
&&& 2.分子检测方法：已经发展了7对引物使用于检测过程中，检测中的阳性对照RNA可以从Bernhard-Nocht Institute in Hamburg, Germany免费获得。检测样品包括血液、粪便、呼吸道分泌物。PCR结果可以辅助临床诊断评价，但是不能肯定或排除疾病的可能；
3.细胞培养方法：利用VERO细胞来检测SARS病人的呼吸道分泌物和血液样品，阳性结果表示SARS病人感染了冠状病毒，阴性结果不表明病人不是SARS。
荧光PCR对新型冠状病毒的检出意义
PCR是一种体外基因复制技术，可在几十分钟内把基因扩增到数百万倍以上，使基因便於检测，具有快速、灵敏、特异、简便的优点，尤其是近年发展的荧光PCR技术在原PCR的基础上，通过引入特异性探针和荧光信号的动态检测，避免了PCR后处理，灵敏度和特异性均得到显著的提高，而且这种检验方法将不局限于对血样的监测，粪便、血浆和漱喉液也可成为快速检测的依据。
有利于早期诊断。
ＳＡＲＳ的临床诊断主要是通过免疫学测定患者的抗体来完成，但是ＳＡＲＳ患者抗体的出现一般是在有ＳＡＲＳ症状14天后才能测定出来。而ＰＣＲ试剂以其灵敏度高的特点，在发病症状的初期就能检测出患者样本中ＳＡＲＳ病毒的存在，填补了ＳＡＲＳ病毒抗体检测0&14天的空白。这种辅助诊断的方式有利于ＳＡＲＳ病人的早期发现、早期治疗、早期隔离，避免疫情的扩散和蔓延。
2）荧光PCR法方便简单
从样本取材到结果只需数小时即可完成，而且这种方法适用于粪便、血浆和漱喉液等样本中ＳＡＲＳ的定性和定量检测，扩大了ＳＡＲＳ样本检测的采集范围，降低了采集的难度。
3）荧光PCR相对于其它检测方法大大减低了假阳性
通过全自动的检测技术减少了检测中的污染，提高了采集的安全性和检测率，降低了漏诊率。
4）应用范围广泛
这种方法除了用于ＳＡＲＳ流行病源的筛查、环境污染的检测和临床应用外，还将用于口岸的检验检疫，如动植物、食品、血液制品的ＳＡＲＳ病毒的核酸检测。
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硕士学位论文
装甲RNA病毒样颗粒的制备及其在荧光PCR检测禽流感病毒中的
姓名：窦敏
申请学位级别：硕士
专业：细胞生物学
指导教师：沈明山
座机电话号码
厦门大学学位论文原刨性声明
兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。本人在论文
写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标明。本人依法
享有和承担由此论文产生的权利和责任。
声明人 签名 ： 变叙
■年西月≯日
厦门大学学位论文著作权使用声明
本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大学有权保留
并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版，有权将学位论文用
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，在年解密后适用本授权书。
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嚏氛 日期：
导师签名：C左≥近力日期： 砷7
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