【摘要】：研究背景及目的急性心肌梗死引起心肌细胞缺血缺氧性损害,出现程序性凋亡或坏死,产生左室病理性扩张及左室射血分数降低。心肌细胞再生能力有限导致心肌梗死区的死亡心肌细胞被成纤维细胞替代,产生无收缩功能的胶原瘢痕组织,最终导致缺血性心肌病、心力衰竭的发生。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)治疗急性心肌梗死的治疗效果已在许多大型灵长类动物实验及临床试验中得到证实。MSCs具有低免疫原性、多向分化潜能、干性维持及获取方便等优势。但是,心梗后不利的微环境导致移植到心梗周边区的细胞存活率很低,这成为MSCs有效治疗的瓶颈。我们团队以往的研究发现缺氧预处理(hypoxia preconditioning,HP)的MSCs的存活能力明显增强,通过对正常培养的MSCs和缺氧预处理MSCs两组细胞的基因组芯片分析,发现缺氧预处理能明显上调MSCs的瘦素(leptin)水平,并且提出瘦素可能参与了 MSCs治疗心肌梗死的作用。然而,瘦素是否通过独立保护MSCs抗凋亡而促进其疗效以及相应的分子机制尚不清楚。为此,本博士研究课题将首先着力于证实瘦素是否具有保护MSCs抗凋亡的作用。线粒体的形态结构和稳态的维持是细胞存活的必要条件。线粒体脊结构破坏将导致其中富含的许多前凋亡因子从线粒体中释放到胞浆,而启动凋亡信号通路。线粒体稳态(融合与分裂)的动态平衡是维持正常细胞线粒体功能的重要条件,线粒体分裂有利于清除细胞内受损的线粒体,但过度分裂也会启动线粒体自噬导致细胞凋亡。瘦素是脂肪细胞分泌的肽类激素,在平衡能量代谢、神经内分泌及调节免疫系统方面都有广泛作用。许多研究发现瘦素对线粒体有潜在调控作用。在乳腺癌细胞(MCF-7)中给予瘦素处理后,发现线粒体的动力学稳态和功能有着明显改善;瘦素这一线粒体调控作用在瘦素缺失的ob/ob小鼠中也得到进一步证实。已有文献提出瘦素对心肌细胞的抗凋亡保护作用。因此,本博士论文课题同时也将就瘦素是否同样通过对MSCs线粒体形态结构及其稳态的调节而发挥抗凋亡而保护MSCs的生存展开研究。第一部分:在体内和体外模型中验证瘦素对骨髓间充质干细胞的存活能力的影响目的:在体内和体外模型中验证瘦素对MSCs的存活能力有无影响方法与结果:在体实验部分,首先,分离培养人骨髓来源的间充质干细胞(hMSCs),并利用带有GFP标记瘦素过表达质粒的慢病毒感染hMSCs过表达瘦素,以便将过表达瘦素的hMSCs移植到急性心梗C57BL/6J小鼠心脏治疗备用。我们将C57BL/6J小鼠随机分为三组(每组20只):Ⅰ)心肌梗死(MI)组小鼠给予瘦素过表达hMSCs治疗(hMSClep);Ⅱ)MI组小鼠给予同等细胞数量病毒质粒载体感染hMSCs治疗(hMSCvec);Ⅲ)MI组小鼠给予相同注射体积的DMEM组。我们的结果显示:Ⅰ)在心梗术后3天取材小鼠心脏,切片荧光共染GFP和TUNEL评估hMSCs存活率。与病毒空载组(vector)相比较,移植病毒过表达瘦素的hMSCs组中的hMSCs细胞存活率明显提高(p=0.01)。Ⅱ)在心梗后28天进行超声心动图检测心功能和天狼星红染色评价梗死面积发现,瘦素过表达hMSCs组小鼠的心功能和梗死面积均较对照组有明显缓解。通过术后28天检测血管新生相关标记物提示:hMSCs是通过旁分泌效应增强血管新生而改善心梗后心功能。体外实验建立缺糖缺氧缺血清(glucose 3凋亡蛋白的检测,发现与对照组相比,瘦素预处理hMSCs组的细胞在凋亡应激环境中的抗凋亡能力明显增强。我们收集细胞培养的条件上清液,进行HUVEC细胞的matrigal管腔形成实验,发现与对照组相比,瘦素预处理hMSCs组的条件上清液使HUVEC细胞管腔形成最明显,进一步证实hMSCs的旁分泌效应。第二部分:在体外研究瘦素对间充质干细胞的线粒体动力及功能的改变及其机制探索目的:线粒体是细胞凋亡中重要的细胞器,通过分析线粒体结构和动力的相关调控因子,进一步探索瘦素对hMSCs的线粒体改变的机制方法与结果:在预处理瘦素(50ng/ml)24小时后,再将hMSCs进行GSDH诱导凋亡24小时。通过细胞透射电镜观察hMSCs的超微结构,发现瘦素预处理hMSCs中的线粒体明显增粗增长、脊膨胀;而对照组的线粒体形态则是稀疏、短小的点状样。但是细胞氧耗量的检测发现瘦素预处理组的hMSCs比对照组明显减少,提示我们在凋亡模型中瘦素只对线粒体形态的完整性有保护作用,而对改善线粒体的氧化磷酸化功能没有作用。进一步分析线粒体动力相关因子,发现在瘦素预处理hMCSs组中,线粒体上调控内膜融合与分裂的因子Optic 1(OPA1)的蛋白水平明显上调,但在基因水平无变化。OPA1是与动力相关GTP酶样蛋白,位于线粒体内膜上,调节线粒体内膜的融合与分裂、维持脊结构。OPA1有至少5个亚型,主要为长亚型(a、b)和短亚型(c、d、e)。有趣的是,长亚型OPA1(L-OPA1)和短亚型OPA1(S-OPA1)的功能截然相反,L-OPA1调控线粒体内膜融合,S-OPA1控制线粒体内膜分裂。我们发现,在瘦素预处理组的hMSCs中的L-OPA1明显增多,这符合电镜下观察到的线粒体增粗延长,提示线粒体的病理性融合。通过siRNA进行细胞OPA1的特异性基因沉默方式,证实瘦素对hMSCs的抗凋亡保护作用依赖于OPA1因子。进一步分析调控OPA1的因子后发现,在瘦素预处理hMSCs组,另一个线粒体内膜蛋白OMA1的降解增多。已有文献报道,OMA1对OPA1有负性调节作用,OMA1的降解增加符合上述观察到的OPA1的蛋白水平表达增多。同时,我们发现瘦素通过GSK3磷酸化激活而启动OMA1的泛素化降解途径,并且给予GSK3的抑制剂(SB216763)阻止了 OMA1的降解作用,提示OMA1的泛素化降解依赖于GSK3磷酸化激活。结论:在急性心肌梗死后的恶劣的微环境中,1)瘦素能够通过维持线粒体脊结构的完整性而增强hMSCs的抗凋亡能力;2)瘦素通过依赖于GSK3磷酸化的方式而介导OMA1的泛素化降解,从而减少OMA1对OPA1的剪切而使OPA1的蛋白表达水平增多,促使线粒体融合。我们提出了,瘦素通过作用于GSK3/OMA1/OPA1信号通路而增强hMSCs应激时的抗凋亡能力,为心血管疾病的干细胞治疗提供新的靶点。

【学位授予单位】：浙江大学
【学位授予年份】：2018

【摘要】：随着全球气候的变化,海平面上升、海水入侵、海岸带侵蚀很大程度上影响了土壤水文和土壤肥力条件,海岸带生态系统的水盐肥空间分布格局制约着植被的分布。黄河三角洲贝壳堤是世界三大古贝壳堤之一,而且是世界上最完整的、唯一新老并存的贝壳堤。开展黄河三角洲贝壳堤水分、盐分和养分的时空分异特征和影响因素的研究势在必行。针对贝壳堤湿地生态系统因人为或自然而引起的土壤、水文、养分变化,以海岸带4种不同生境的土壤为研究对象,利用稳定同位素技术与野外定位观测、室内测试分析等传统方法相结合,分析了不同生境中土壤含水量、氢氧稳定同位素、土壤盐分、养分等指标的空间分布特征,探讨不同生境下水分、盐分和养分时空分异特征,对揭示贝壳堤海岸带植物群落和功能的机理具有着重要的科学意义,对退化海岸带植被的保护和恢复有重要的理论指导意义。主要研究结论如下:1.土壤含水量随着土壤深度增加而升高,受降雨、海水、土壤质地、植被覆盖率等因素的影响。与滩涂裸地相比,向海侧和滩脊处表层土壤水δD值和δ~(18)O值对雨水的响应比较敏感,表现出表层土壤水δD值和δ~(18)O值较小,表层以下土壤水δD值和δ~(18)O值较大的趋势,说明向海侧和滩脊处土壤水很大程度上只能靠雨水来补给,60 cm以下土壤水还受到海水横向运移和地下水的补给。积水补给了向陆侧的表层土壤水,使得氢、氧同位素在积水和土壤水之间发生了运移。2.黄河三角洲贝壳堤的土壤pH值在7.32~8.50范围内,呈偏碱性;土壤盐分在0.76~13.57g/kg范围之内,其中从近海侧向向陆侧水平方向上,土壤含盐量表现出先降低后升高的趋势。从土壤质地来看,滨海盐土的土壤含盐量要远远大于贝壳沙土的含盐量。土壤含盐量有明显的季节性,雨季含盐量有向下运移趋势,没有雨季干扰时,由于表聚性,土壤含盐量随着毛管现象有向上运移的趋势,这种作用在滨海盐土区最为明显,贝壳沙生境中的破碎贝壳可以破坏毛管现象,从而阻止盐分向地表运移。土壤阴阳离子中,Ca~(2+)、Cl~-含量较高。土壤含盐量和Na~+、Mg~(2+)、Cl~-、SO_4~(2-)呈现极显著正相关关系,和K~+呈现显著正相关关系,但与Ca~(2+)相关性不显著,说明贝壳堤不同生境中,土壤含盐量主要以钠盐、镁盐、钾盐、氯盐、硫酸盐为主。研究区内,土壤含盐量和pH值呈现显著负相关关系。3.黄河三角洲贝壳堤土壤全氮、全磷和全钾含量分别在0.08~1.08 g/kg、0.16~0.49g/kg、1.50~13.41 g/kg之间。与滩涂(裸地)相比,向海侧、滩脊和向陆侧的土壤全氮、全磷、全钾均有一定的垂直分布特征,有向下运移的趋势,即表层(0-20 cm)大于亚表层(20-60 cm)。土壤全氮和全磷含量具有季节性变化,即生长季初期(5月)开始降低,生长旺季(7月)含量最低,生长季末期(9月)又开始升高;随着季节的更替,表层土壤全钾含量变化幅度远远大于亚表层土壤全钾含量。凋落物分解和土壤风化是贝壳堤土壤养分的主要来源。4.不同生境中土壤微生物生物量碳(MBC)、土壤微生物生物量氮(MBN)、土壤微生物生物量磷(MBP)均值表现为滩脊向陆侧滩涂向海侧,且表现出明显的垂直分布特征:0-5cm5-10cm10-20cm20-40cm40-60cm。土壤MBC、MBN、MBP占土壤有机碳(SOC)、全氮(TN)、全磷(TP)百分比变化范围分别为1.09%~3.48%、2.62%~7.27%、0.78%~2.86%,滩脊、向陆侧和滩涂处MBC/SOC无显著差异,但显著高于向海侧MBC/SOC。土壤MBN/TN、MBP/TP的变化趋势为滩脊和向陆侧向海侧和滩涂。滩脊和向陆侧土壤微生物碳、氮、磷的非生物限制性因子为土壤含水量、pH值、含盐量和粒度;向海侧和滩涂区域土壤微生物碳、氮、磷的非生物限制性因子为含水量和pH值。滩脊、向陆侧和滩涂土壤微生物生物量碳、氮、磷及土壤养分间的相关显著或者极其显著,表明土壤微生物生物量碳、氮、磷可以作为判断黄河三角洲贝壳堤土壤肥力状况的生物学指标。

【学位授予单位】：山东农业大学
【学位授予年份】：2018

【摘要】：目的观察优化急诊护理流程对急性颅脑外伤患者抢救效果的影响。方法我院2017年1月至2018年1月优化急诊护理流程,比较我院优化急诊护理流程前后急性颅脑外伤患者抢救效果。结果优化急诊护理流程前患者缴费时间、急诊停留时间、备皮时间以及急诊至手术室转移时间均明显长于优化急诊护理流程后,优化急诊护理流程前患者死亡率明显高于优化急诊护理流程后(14.3%VS2.9%),数据差异具有统计学意义(P0.O5)。结论对于急性颅脑外伤患者抢救中优化急诊护理流程可有效缩短患者抢救时间,从而降低患者死亡率。