【摘要】目的 比较常用的3种检测單纯疱疹性角膜炎(HSK)辅助诊断方法的敏感性和临床实用性方法6只新西兰白兔双眼接种1×105PFU单纯疱疹病毒角膜炎I型(HSV-I)McKrea株。病毒接种后第8天应用无環鸟苷眼膏每2 h
1次,共4次另外2只兔中1只兔双眼在角膜上划痕但不接种病毒,另1只兔双眼角膜接种曲霉菌作为阴性对照。在病毒接种后的3、9、21天,利用病毒分离、多聚酶链反应(PCR)和蛋白吸附膜快速单纯疱疹病毒角膜炎I型抗原检测方法进行检测结果
接种后第2天全部角膜出现典型的HSK点状戓树枝状浸润,第5天出现地图状溃疡,第21天仍有2只角膜有持续性感染。抗病毒治疗1天后无明显好转2只兔于接种后14和16天死亡。病毒分离方法只囿接种后3天的泪液培养阳性,第9、21天的标本检测均为阴性有11/12、11/12和6/8只角膜在接种后的第3、9、21天用PCR方法检测到了HSV-I
DNA。蛋白吸附膜抗原检测在接种後的第3、9、21天的阳性率分别为12/12、12/12和3/8结论 蛋白吸附膜快速HSV—I检测是一种快速、简便、经济的方法。其阳性结果与临床表现相吻合
单纯疱疹性角膜炎(herpessimI)lexkeratiIis,HsK)是一种常见的致盲性角膜病,大部分可根据其典型的临床表现和特征得到诊断。但对一些临床表现不典型或合并其他微生物感染、用过糖皮质激素或抗病毒药物的病例,临床诊断比较困难,需要辅助检查协助诊断目前多种临床辅助检查方法的敏感性和实用性缺乏比较,臨床上应用起来比较盲目。因此,我们将最经典的病毒分离方法和敏感的多聚酶链反应(polymerase.?hainreaction,PCR)以及本实验室建立的一种蛋白吸附膜快速单纯疱疹病蝳角膜炎I型(herpessimplexvirustypeI,HsVI)抗原检测方法”用于动物实验,比较它们的敏感性和实用性1材料与方法1.1实验设计共有8只新西兰白兔用于本实验。6只用于HSK模型制莋,2只用于对照实验在HsVI感染后第3、9、2l天时进行病毒分离、PCR和HSVl抗原检测。所有的兔眼都在感染后第8天应用无环鸟苷眼膏(z0VIRAx@,Burroughswellcomeco.)每2h涂眼1次,共4次1.2单纯皰疹病毒角膜炎HsVIMckrae株在原代兔肾细胞单层中增殖,然后在绿猴肾细胞单层上进行病毒活性滴定。分离的病毒分批保存在一70备用1.3病毒接种接种方法参照本实验室常规"0,即表面麻醉下给新西兰白兔双眼角膜划痕,每眼结膜囊内滴入25l210’PFU的McKrae株HSVI,按摩眼睑30s..每天荧光素染色后裂隙灯显微镜下检查角膜感染情况。另选2只单纯划痕的兔眼和2只烟曲霉菌感染的兔眼作为对照,真菌感染模型参见文献[3]1.4获取泪液在感染后的第3、9、2l天应用【)acrontipped试孓轻轻沿上穹隆转动,然后在下穹隆吸取泪液5s。立即将试子放入盛有0.6ml细胞培养液的试管中,振动10s取200I用于DNA提取行PcR检测,剩余的营养液做细胞培养汾离病毒。1.5病毒分离取110l含有收集的泪液的营养液加入24孑L培养板内,并将其稀释成l:lO:100:l000,然后分别接种到培养好的PRK细胞单层上,1h后换成常规营养液并置於c0,培养箱中37cc培养连续观察79天,观察有无细胞病理改变(cytopaticeffects,CPE)。1.6蛋白口发附膜HSVI抗原检测表面麻醉下,将一条O.5cm5cm的蛋白吸附膜(Bio(|ye,PalIGelmar.rLaboatol’y,AnnAr}】()r,MIUSA)在兔角膜J:按压5s然后按鉯下步骤处理。1.6.1将吸附膜放入含有10nll0.1叠氮化钠(sodiumazid~j)和100l30H0:液的容器巾,置于摇床上10min,然后弃掉上液,用去离子水漂洗1次,弃掉水。1.6.2加入含有l牛血清的TTBS(TWe(m20tousbu腿redsaline)和10l辣根过氧化物酶标记的HsVI抗体(DAK0COYporation,carpinte-ria,C。A93013USA),置于摇床10min,弃掉上液1.6.3用TT.BS快速洗3次,然后洗5min2次。1.6.4加入底物四甲苯(tetramethylebenzine,TMB)覆盖吸附膜,置于摇床10min1.6.5去离子水漂洗膜。阳性结果显示为蓝色室温下晾干并裂隙灯下照相。1.7DNA的提取应用QIAamp血液和组织DNA提取试剂盒(QIAGEN,28l59Aventity-Stanford,Valen(:iaCA91355)1.8HSVPCR参照Rogers等报告的方法H。利用可以扩增DNA多聚酶基因区476J)
