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什么是体外试验？体内试验？
体外试验是没有进入临床阶段进行的实验，如动物试验、实验室试验等，体内实验是进入临床试验阶段，已经是非常安全的了，被实验人必须使自愿的。
你好，药敏试验，是指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验，测试抗菌药在体外对病原微生物有无抑制作用，以指导选择治疗药物和了解区域内常见病原菌耐药性变迁，有助于经验...
答: 北京做人流要多少钱?目前很多人都会问北京做人流要多少钱，北京做人流的价格一般都在1000块左右，具体差别就在于个人情况，是否有别的妇科疾病~如果有可能就会贵些，...
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淘豆网网友近日为您收集整理了关于抗菌药物敏感性试验及细节耐药检测的文档，希望对您的工作和学习有所帮助。以下是文档介绍：抗菌药物敏感性试验及细节耐药检测 1抗菌药物敏感性试验与细节耐药性监测来源:检验医学在线
南网编辑 一、需氧菌及兼性厌氧菌的药物敏感试验(一)纸片琼脂扩散法纸片琼脂扩散法又称 Kirby-Bauer 试验,是操作最简易、使用最广泛的抗菌药物敏感性试验。1.试验原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制,从而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系,即抑菌圈越大,MIC 越小。2.培养基和抗菌药物纸片(1)培养基:水解酪蛋白(Mueller-Hin-ton,MH)培养基是 CLSI/NCCLS 采用的兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基,pH 值为 7.2~7.4,对那些营养要求高的细菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、链球菌等需加入补充物质。琼脂厚度为 4mm。配制琼脂平板当天使用或置塑料密封袋中 4℃保存,使用前应将平板置 35℃孵育箱孵育,使其(来源：淘豆网[/p-.html])表面干燥。(2)抗菌药物纸片:选择直径为 6.35mm,吸水量为 20ul 的专用药敏纸片用逐片加样或浸泡方法使每片含量达到规定所示。含药纸片密封储存 2~8℃或-20℃无霜冷冻箱内保存,β-内酰***类药敏纸片应冷冻储存,且不超过 l 周。使用前将储存容器移至室温平衡 l~2h,避免开启储存容器时产生冷凝水。3.细菌接种细菌接种采用直接菌落或细菌液体生长方法。用 0.5 麦氏比浊标准的菌液浓度。校正浓度后的菌液应在 15min 内接种完毕。接种步骤如下:①用无菌棉拭子蘸取菌液,在管内壁将多余菌液旋转挤去后,在琼脂表面均匀涂片接种 3 次,每次旋转 60°,最后沿平板内缘涂抹 1 周;②平板置室温下干燥 3~5min,用纸片分离器或无菌镊将含药纸片紧贴于琼脂表面;③置 35℃孵育箱孵育 16~18h 后阅读结果,对甲氧西林和万古霉素药敏感试验结果应孵育 24h。4.结果判断和报告用精确度为 1mm 的游标卡尺量取抑菌圈直径(抑菌圈的边缘应是无明显细菌生长的区域),当葡萄球菌对苯唑西林的(来源：淘豆网[/p-.html])药敏试验或肠球菌对万古霉素的敏感试验,围绕纸片周围只要有极少细菌生长提示为耐药。对另外一些菌,在抑菌圈内散在菌落生长提示可能是混合培养,必须再分离鉴定及试验,也可能提示为高频突变株。变形杆菌迁徙生长使抑菌圈内生成的薄层菌可忽略不计。由于培养基内抗药成分使其对甲氧苄啶引起的轻微细菌生长,生长层小于 20%可忽略不计。根据 CLSI/NCCLS 标准,对量取的抑菌圈直径判断病原菌对该药物的敏感性形式(敏感/中度敏感/中介、耐药)。2(二)稀释法如果要进一步检测某种病原菌对多少剂量(浓度)的抗菌药物呈敏感时,就必须使用稀释法(dilution method)。稀释法包括两种:肉汤稀释法和琼脂稀释法,分别介绍如下:1.肉汤稀释法有常量稀释法(mac-rodilution)和微量稀释法(microdilution),前者含药肉汤含量每管≥l.0ml(通常 2m1),后者每孔含 0.1ml。商品化的微量稀释板上含有多种经对倍系列稀释的冻干抗生素,操作方便,广泛应用于临床。(1)培养基:使用 M-H 肉汤(来源：淘豆网[/p-.html]),需氧菌、兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在该培养液中加入补充基质可支持流感嗜血杆菌、链球菌生长。培养基制备完毕后应校正 pH 值为 7.2~7.4(25℃)。离子校正的 M-H 肉汤(CAMHB)为目前推荐的药敏试验培养液。(2)药物稀释①药物原液制备:抗菌药物直接购自于厂商或相关机构,所需的溶液量或粉剂量可根据下述两公式进行计算。质量(mg)=溶剂(ml)×浓度(ug/ml)/分析效能(ug/mg)容积(m1)= 质量(mg) ×分析效能(ug/mg)/浓度(ug/ml)配制各种抗菌药物的溶剂根据药物性能选择蒸馏水、pH 值为 6.0,0.1mol/L 磷酸盐缓冲液等。一般原液浓度不低于 1 000ug/ml 或 10 倍于最高测试浓度,原液应储存于-60℃以下,保存期不超过 6 个月。②稀释抗菌药物的制备:行 2 倍系列稀释,使其终浓度(ug/m1)为 512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0、0.5、0.25、0.125 等。(3)菌种接种:配(来源：淘豆网[/p-.html])制 0.5 麦氏浓度菌液,用肉汤(常量稀释法)、蒸馏水或生理盐水(微量稀释法)稀释菌液,使最终菌液浓度(每管或每孔)为 5×105CFU/ml,稀释菌液于 15min内接种完毕,35℃孵育 16~20h,当试验菌为嗜血杆菌属、链球菌属孵育时间为 20~24h,试验葡萄球菌和肠球菌对苯唑西林和万古霉素的药敏试验孵育时间必须满 24h 以上。(4)结果判断:以在试管内或小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为 MIC(ug/m1)。甲氧苄啶(甲氧苄***嘧啶)或磺***药物的肉汤稀释法敏感试验的终点判断,以细菌数为阳性对照的 80%即可作为判断细菌生长指标。微量稀释法时,常借助于比浊计判别是否有细菌生长。2.琼脂稀释法琼脂稀释法是将药物混匀于琼脂培养基中,配制含不同浓度药物平板,使用多头接种器接种细菌,经孵育后观察细菌生长情况,以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度测得 MIC。(1)培养基:M-H 琼脂为一般菌药敏试验的最佳培养基,调整 pH 值在 7.2~7.4(25℃),过高或过低的 pH (来源：淘豆网[/p-.html])值会影响药物效能。(2)含药琼脂制备:将已稀释的抗菌药物按 1:9(配制的药物溶液:琼脂培养基)加入,加热溶解琼脂,在 45~50℃水浴平衡融化 MH 琼脂中,充分混合倾入平皿,琼脂厚度为 3~4mm。室温凝固后的平皿装入密闭塑料袋中,置 2~8℃,储存日期为 5d,对易降解药物如含3头孢克洛,在使用 48h 之内制备平板,使用前应在室温中平稳放于孵育箱或层流罩中 30min以使琼脂表面干燥。(3)细菌接种:将 0.5 麦氏比浊度菌液稀释 10 倍,以多头接种器吸取(为 1~2ul)接种于琼脂表面,稀释的菌液于 l5min 内接种完毕,接种后置 35℃孵育 16~20h(MRS、VRE 孵育时间需满 24h),奈瑟菌属、链球菌属细菌置于 5%C02、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。(4)结果判断:将平板置于暗色、无反光表面上判断试验终点,以抑制细菌生长的药物稀释度为终点浓度(含甲氧苄啶平板上可见少许散在细菌生长)。试验菌的结果报告可用 MIC(ug/mg)或用敏感(S)、中介(I)和耐药(R)(来源：淘豆网[/p-.html])报告。(三)E 试验E 试验(Epsilometer test)是一结合稀释法和扩散法原理对细菌药敏试验直接定量的技术。1.试验原理 E 试条是一条 5mm×50mm 的无孔试剂载体,一面固定有一系列预先制备的,浓度呈连续指数增长稀释抗生素,另一面有读数和判别的刻度。抗生素的梯度可覆盖有20 个 MIC 对倍稀释浓度的宽度范围,其斜率和浓度范围对判断有临床意义的 MIC 范围和分界点值具有较好的关联。将 E 试条放在细菌接种过的琼脂平板上,经孵育过夜,围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈,圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度,又称抑制浓度(IC),它与MIC 呈高度相关。2.细茵接种和加样使用厚度为 4mmM-H 琼脂平板,用 0.5 麦氏浓度的对数期菌液涂布,待琼脂平板完全干燥,用 E 试验加样器或镊子将试条放在已接种细菌的平板表面,试条全长应与琼脂平板紧密接触,试条 MIC 刻度面朝上,浓度最大处靠平板边缘。采用 CLSl/NCCLSAST 执行标准推荐孵育条件。3(来源：淘豆网[/p-.html]).结果判断和报告读取椭圆环与 E 试验试条的交界点 IC 值。E 试验 IC 值与 CLSl/NCCLS 的稀释法 MIC 参考值高度相关,二者直接相对应,CLSl/NCCLS MIC 折点值适用于 E 试验。但在判断结果时出现和细菌、药物、耐药机制和技术处理有关判断问题时应予以修正。二、苛养菌的药物敏感试验肺炎链球菌及其链球菌属、流感嗜血杆菌、奈瑟菌属等苛养菌不能在普通环境及普通 MH 培养基中快速生长,上述的药敏试验条件不适合它们。它们需要更为复杂的培养基、孵育条件,在进行药敏试验时,质控菌株、药敏抗生素的选择、结果解释标准也有所不同。下面分别介绍几种重要苛养菌药敏试验的试验条件选择、质量控制方法和结果判断注意事项。各自的结果判断标准请参考 CLSl/NCCLS 手册。(一)嗜血杆菌属1.试验条件4(1)培养基:使用嗜血杆菌属试验培养基(hemophilus test medium,HTM)。(2)接种菌液:菌悬液终浓度为 5×105CFU/ml。(3)孵育条件:35℃下孵育 (来源：淘豆网[/p-.html])20~24h 观察结果。对于扩散法,35℃、5%~7%C02 下孵育l6~18h 观察结果。2.质量控制流感嗜血杆菌 49247、流感嗜血杆菌 49766、大肠埃希菌 35218(用于β-内酰***抗生素/β-内酰***酶抑制剂)为推荐参考菌株。3.结果判断注意事项(1)血液、脑脊液分离株仅需做氨苄西林、三代头孢菌素中的一种、***霉素和美罗培南。(2)耐氨苄西林和阿莫西林的流感嗜血杆菌大多产 TEM 型β-内酰***酶。大多数情况下,直接检测β-内酰***酶更快。(3)β-内酰***酶阴性而氨苄西林耐药(β-Lactmase-negative,ampicillin-resistant,BL-NAR)的流感嗜血杆菌株少见。然而,不论其体外药敏试验是否出现敏感,均应考虑为阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、头孢克洛、头孢盂多、头孢尼西、哌拉西林/他唑巴坦耐药。(二)肺炎链球菌1.试验条件(1)培养基:肉汤稀释法使用离子校正的马冻融血培养基。(2)接种菌液:菌悬液终浓度为 l05CFU/ml。(3)孵育条件:35℃下(来源：淘豆网[/p-.html])孵育 20~24h。2.质量控制肺炎链球菌 49619、大肠埃希菌 35218(用于β-内酰***抗生素/β-内酰***酶抑制剂)为推荐参考菌株。3.结果判断注意事项(1)对青霉素敏感者,均可认为对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、阿莫西林/舒巴坦、头孢克洛等三代头孢菌素敏感;青霉素中介或耐药株,不推荐做上述药物的药敏试验,因为对青霉素耐药的肺炎链球菌对上述抗生素治疗的疗效很低。应当及时通知临床医生,然后应报告对头孢曲松、头孢噻肟和美罗培南的 MIC。(2)静脉注射高浓度青霉素(肾功能正常的*** 2×106U/4h)或氨苄西林(29/6h)对青霉素中介的肺炎链球菌是有效的。标准剂量的头孢曲松、头孢噻肟对中介的肺炎链球菌也有临床疗效,但在发现该菌株引起的脑膜炎时常用最大剂量治疗。(三)肺炎链球菌外链球菌属1.试验条件(1)培养基:肉汤稀释法同肺炎链球菌,琼脂稀释法用含 5%羊血琼脂。(2)接种菌液:菌悬液终浓度为 5×105CFU/ml。(3)孵育条件:35℃下孵育 20~2(来源：淘豆网[/p-.html])4h。琼脂稀释法需 5%C0。。2.质量控制肺炎链球菌 49619 为推荐质控菌株。53.结果判断注意事项(1)化脓性链球菌一般不需做青霉素药敏试验,该菌目前对青霉素仍为敏感株,只有某些无乳链球菌可能会对青霉素产生中介结果。(2)对青霉素敏感的链球菌,同时被认为对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、阿莫西林/舒巴坦、头孢克洛、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松、头孢唑肟等敏感,毋需对这些抗生素进行药敏试验。(3)青霉素或氨苄西林中介的菌株,需用氨基糖苷类联合用药进行治疗。(4)对红霉素耐药者或敏感者常提示对阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素耐药或敏感。三、分枝杆菌的药物敏感试验(一)结核及慢生长分枝杆菌的药物敏感试验由于结核及慢生长分枝杆菌生长缓慢,在生长前,药物已扩散至培养基中,不能有效影响其生长。故不适用于需氧或兼性厌氧菌的药敏试验。结核及慢生长分枝杆菌药敏试验的药敏培养基、含药浓度、接种菌量、结果解释等都有其特殊性。比例法是 WH0/IUATLD 全球结核病耐药监测方案中推荐的方法,目前国外普遍采用此法。国内多采用绝对浓度法,据报道,该法比比例法的耐药菌检出率要低 5%~10%。某些微生物自动鉴定和药敏系统则采用放射核素等方法。1.绝对浓度法(absolute concentration method)该法以“无生长”为终点或为最低抑菌浓度(MIC)来判断耐药与否,每种药物需制备两种不同浓度的含药培养基,同时用不含药培养基作为对照,接种菌液最终浓度为 1ug/ml,37℃培养 4 周观察结果。判断标准为对照培养基上细菌生长良好,含药培养基上菌落&20 个判为耐药。(1)试验条件①培养基:改良罗氏培养基(Lowenstein-Jensen,L-J)。②试验药物:试验用药物和药物浓度(表 6-2)。③接种菌液:多点刮取培养物少许,置于磨菌器中,用磨菌捧捻磨,使呈乳酪样,以 0.5%Tween-80 生理盐水稀释,与比浊管比浊,配制成 lmg/ml 菌悬液,然后以灭菌生理盐水稀释至 l0-2mg/ml。试验时每点接种 lOOul。④孵育条件:37℃下孵育 4 周。(2)质量控制:①结核分枝杆菌 27294 为一线、二线药的敏感质控菌株;②结核分枝杆菌 H37Rv 35820 为链霉素耐药质控菌株;③结核分枝杆菌 H37Rv 35822为异烟肼耐药质控菌株;④结核分枝杆菌 K37Rv 35826 为环丝氨酸耐药质控菌株;⑤结核分枝杆菌 H37Rv 35827 为卡那霉素耐药质控菌株;⑥结核分枝杆菌 H37Rv 35828为吡嗪酰***耐药质控菌株;⑦结核分枝杆菌 H37Rv 35830 为乙硫异烟***耐药质控菌株;⑧结核分枝杆菌 H37Rv 35837 为乙***丁醇耐药质控菌株;⑨结核分枝杆菌 H37Rv 35838 为利福平耐药质控菌株。6(3)结果判断注意事项:每周阅读平板 1 次。根据 CLSI/NCCLS 药敏测定时间,结核分枝杆菌为 3 周,慢生长分枝杆菌为 2 周,到 4 周末终止培养。结果报告方式分敏感、低浓度耐药、高浓度耐药和实报菌落数 4 种。判断标准如下:①敏感。含药培养基上无菌落生长。②低浓度耐药。低浓度含药培养基上菌落数&20 个,高浓度含药培养基上无或极少菌。③高浓度耐药。低浓度含药培养基上菌落茂盛,高浓度含药培养基上菌落数&20 个(+菌落数约占斜面面积 l/4;++菌落数约占斜面面积 l/2;+++菌落数约占斜面面积 3/4;++++菌落呈菌苔样生长)。④实报菌落数。低浓度含药培养基上菌落数&20 个时,实报菌落个数。2.比例法(proportional method) 此法是在一种含药培养基上接种两种不同浓度的菌液,以含药培养基上的菌落数与不含药培养基上的菌落数之比作为药敏判定标准。(1)试验条件:①培养基 Milddle brook7H10 琼脂。②试验药物。在表 6-2 中列出了 CLSI/NCCLS 推荐的抗结核分枝杆菌比例法药敏试验用药物和药物浓度。③接种菌液。调整细菌浓度为 1 麦氏浓度,再将其用 7H9 肉汤稀释成 102和 104倍两种浓度。分别吸取两种不同浓度的菌液 l0ul(标准接种环一接种环)接种于同一个浓度的含药培养基及对照培养基。④孵育条件。37℃下孵育 4 周。(2)质量控制:基本同绝对浓度法。(3)结果判断注意事项:在两个浓度梯度的平板中,计数易数出菌落数的那一个,与对照平板菌落数相比,算出耐药百分比。3.放射核素法 BACTEC—TB 460 等仪器检测系统使用放射核素法进行快速检测。具体使用见产品说明书。(二)快速生长分枝杆菌的药物敏感试验快速生长分枝杆菌在合适的固体培养基上孵育 5~7d 肉眼可见细菌菌落生长。其药物敏感试验常以肉汤稀释法进行,操作方法基本同需氧和兼性厌氧菌。菌种用胰大豆肉汤或 CAMHB 加上 0.02%Tween-80,以避免细菌的聚集。30℃孵育 3~5d 后观察结果。四、厌氧菌的药物敏感试验由于厌氧菌对目前常用抗生素的敏感性较为稳定,加之厌氧菌培养要求特殊,临床实验室一般不做体外药敏试验。发生下述临床情况时应考虑体外药敏试验:①明确厌氧菌引起的严重感染;②已确诊的厌氧菌感染,经验性的选药治疗未能奏效;③需长期用药的厌氧菌感染。厌氧菌体外药敏试验基本原理和方法与需氧菌相同,只是培养基、操作环境和培养条件等应根据厌氧菌的特定需要变动。1.培养基采用布氏血琼脂(Brucella blood agar)。配制完毕的布氏血琼脂储存期不能超过 7d(4~l0℃),最好不能长于 72h。含亚***培南和克拉维酸的培养基必须使用当天制作平板。布氏心脑浸液加入 3%~5%冻融羊血为稀释法培养基。72.孵育条件厌氧箱和厌氧罐是必需配置的,气体条件为 80%N2、l0%H2 和 l0%C02,还需加入冷催化剂钯粒和亚甲蓝指示剂,35~37℃孵育 48h。3.质控菌株脆弱类杆菌 25285、多型类杆菌 29741、迟缓优杆菌 43055。五、抗菌药物敏感试验的质量控制抗菌药物药敏试验必须做有效的质量控制,以保证检验结果的精确性、可靠性和可重复性。要完成有效的药物敏感性试验,除了必须采用可靠的试剂和检测系统外,实验室应建立一套完善的操作流程和评价程序,以规范试验中使用的各种试剂,规范操作者的操作和对结果的判断。(一)质量控制参考菌株的质控试验除了阳性生长对照试验、纯度对照试验、接种量对照试验、结果终点判读对照试验等外,临床微生物室常通过对已知的抗生素敏感的菌株进行测试,以达到综合质量控制目的。CLSI/NCCLS 2004 AST 执行标准推荐下述参考菌株为稀释法 MIC 的测定:金黄色葡萄球菌 29213,金黄色葡萄球菌 43300,肺炎链球菌 49619,粪肠球菌 29212,粪肠球菌 51299,淋病奈瑟菌 49226,大肠埃希菌 2,肺炎克雷伯菌 700603,铜绿假单胞菌 27853,流感嗜血杆菌 49247,流感嗜血杆菌 49766。一般来说,这些菌株同样也适用于琼脂扩散法。金黄色葡萄球菌 25923 只用于琼脂扩散试验。大肠埃希菌 35218 仅推荐用于含β-内酰***酶抑制剂(如克拉维酸、舒巴坦或三唑巴坦的抗生素)药敏试验;金黄色葡萄球菌 43300 和 29213 使用于苯唑西林盐琼脂筛选试验;粪肠球菌 51299 和 29212 使用于万古霉素筛选试验和高水平耐氨基糖苷类肠球菌药敏试验;肺炎克雷伯菌 700603 使用产 ESBLS 的试验。质控菌株需用临床分离株相同的培养基和方法进行标准法的药敏试验。CLSI/NCCLS 质控菌株的 MIC 预期值和抑菌圈直径参见 CLSI/NCCLS 手册。质控菌株稀释法药敏试验的 MIC应位于整个试验浓度范围的中部。储存质控菌种应在菌种保存液(50%胎牛血清肉汤或 10%~l5%胰大豆肉汤)中置于-20℃或-80℃或液氮中,也可冷冻真空保存。冻存的或冷冻真空的培养物至少在试验前需传代2 次。工作中的质控菌株在胰大豆琼脂(一般菌)或巧克力琼脂(苛养菌)斜面上每周传代一次。在试验前传代的菌株应在琼脂平板上分离取得单个菌落。质控试验应每日进行。MIC 在预定值范围外时,需查找误差原因并予以纠正。产生误差的原因包括:①质控菌株选用不当;②细菌菌液浓度不对;③培养基储藏不当或过期失效;④质控菌株或培养基被污染;⑤培养基平板的制作不符合要求;⑥孵育的温度和气体条件不符。(二)药敏试验平板、肉汤的质量控制8常量稀释法的含药肉汤试管、微量稀释法的条板和稀释琼脂平板在使用前均应进行合适质控菌株的测试,观察其 MIC 是否在预期值范围,不在预期值范围内者应丢弃。当然,上述培养基应做无菌试验,至少每批抽样一支,孵育过夜,观察细菌有无生长,以确保培养基无菌。MH 琼脂可用铜绿假单胞菌 227853 作为质控菌株,用 10ug 含药的庆大霉素纸片做药敏试验,其抑菌环直接应在 CLSI/NCCLS AST 执行标准预定值范围内。六、耐药性监测的分子遗传学随着分子细菌遗传学和分子生物学技术的不断进步,微生物对抗生素耐药性的遗传学机制不断明了,许多用于检测抗生素耐药性的基因检测方法,如 PCR、PCR-RFLP 分析、PCR-SSCP 分析、PCR-SSP、基因芯片分析、DNA 序列测定等,得以发展并在临床实验室应用。与常规方法相比,基因检测方法检测抗生素耐药基因有下述优点:有些细菌不能或不易培养,只能检测其基因型;能快速鉴定慢生长细菌的耐药性,能早期指导临床医生治疗用药;有助于判定 MIC 位于折点或折点附近的细菌药敏试验结果;在细菌耐药性的流行病学追踪调研中,基因检测比抗生素药敏方法准确。当然,目前抗生素耐药性的基因检测方法尚处于发展早期。既没有完全弄清细菌耐药的遗传学机制,也没有建立起检验标准。基因检测药敏试验的主要不足在于:细菌对同一抗生素的耐药通常可由多种耐药机制引起,基因检测方法通常只能检测某一特定的耐药,而抗生素药敏试验则能用一种培养分析检测不同形式的耐药。1.β-内酰***药物耐药基因的检测(1)耐苯唑西林金黄色葡萄球菌基因的检测:苯唑西林 MIC 值为 2~8ug/ml 被判为 MRsA(耐苯唑西林金黄色葡萄球菌)的金黄色葡萄球菌可能具有 mecA 基因,也可能是因为产高水平β-内酰***酶,以至缓慢水解苯唑西林。临床治疗 MRSA 引起的感染首选万古霉素,而治疗产高水平β-内酰***酶菌株所致感染,则应使用对酶稳定的β-内酰***类药物或β-内酰***/β-内酰***酶抑制剂合剂。(2)肺炎链球菌β-内酰***耐药基因的检测:肺炎链球菌可获取其他肺炎链球菌或其他链球菌染色体 DNA 而修饰自身 PBP(青霉素结合蛋白)导致耐药。PBP2b 基因序列(该序列仅出现于青霉素敏感菌株)的 PCR 阴性则提示可能介导耐药。(3)革兰阴性菌β-内酰***基因的检测:编码革兰阴性菌中的 TEM、SHV、OXA 等β-内酰***酶的基因的 DNA 探针和 PCR 引物已能合成,可用于基因检测方法检测。还可采用等电聚焦电泳和 DNA 测序作为鉴定新的β-内酰***酶基因的筛选工具。2.氨基糖苷类耐药基因的检测革兰阴性细菌具有多种不同类型的耐氨基糖苷类耐药基因,如转乙酰基酶、转腺苷酶和转磷酸基酶编码基因。目前为止,尚无一种 DNA 探针或 PCR 引物预测它们的耐药性。9革兰阳性细菌对氨基糖苷类的耐药性较单一,通对 DNA 和 PCR 方法可检测出氨基糖苷类高水平耐药基因,如检测肠球菌 ant(6)链霉素耐药基因和编码庆大霉素耐药的 aac(6’)-aph(2’)基因。3.大环内脂、林可霉素、米卡霉素(密柑霉素)耐药基因的检测 mefA 和 mefE 为大内脂类抗生素泵出基因。肺炎链球菌耐红霉素,常由 mefE 基因介导。红霉素***酶基因(erm)介导大环内酯类、林可霉素和米卡霉素耐药。msrA 基因仅介导对大环内脂类和米卡霉素耐药。msrA 的 PCR 分析法可判定是存在 msrA 还是 crmA,以辅助是否可选用***洁霉素治疗耐红霉素葡萄球菌感染。4.喹诺***耐药基因的检测喹诺***耐药的两大主要机制为:①靶位改变。DNA 解旋螺旋酶(由 gyrA 和 gyrB 编码)和拓扑异构酶(由 parC 和 parE 编码)改变;②药物主动泵出。耐药常与 9yr 和 par 位点突变相关。PCR 技术扩增后测定 gyrA、parC 和 parE 基因的核酸序列有助于检测对喹诺***的耐药性。5.糖肽类耐药基因的检测肠球菌耐药性有几种不同的基因,包括 vanA、vanB、vanCl、vanC2、vanC3、ranD 等,检测上述基因的 DNA 探针和 PCR 方法已有报道。日本、美国还报道了对糖肽类抗生素敏感性降低的金黄色葡萄球菌,由于耐药机制不清,目前尚未有相应的基因检测方法。VanA 型对万古霉素和替考拉宁均高度耐药,VanB 型对万古霉素呈不同水平的耐药性,对肽可霉素敏感。用 PCR 方法检测肠球菌 VanA 基因可有效地预报多重耐药,抗生素药敏方法则不能区分该耐万古霉素的肠球菌是含 VanA 基因的肠球菌还是含 VanB 基因的肠球菌。6.***霉素耐药基因的检测编码***霉素乙酰基转移酶的基因 CATs 存在于革兰阴性和阳性菌中,介导***霉素耐药。检测 CAT 的 DNA 探针的特异性尚未肯定。7.四环素耐药基因的检测四环素耐药可由 tet 系列的十几种不同基因介导。其中 tet(M)扩散最广,可见于葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、革兰阴性杆菌如弯曲菌属、***加德纳菌、支原体、解脲脲原体和淋病奈瑟菌等等。PCR 检测有助于判断牙周疾病用四环素治疗的疗效。8.磺***耐药基因的检测与磺***耐药相关的耐药基因有 SUⅡ和 StlIII。其中,sulII基因常与转座子如 Tn21 连在一起。转座子能介导多种耐药基因在细菌间传递,因此,sulI基因可作为革兰阴性菌多重耐药的指征。9.甲氧苄啶(TMP)耐药基因的检测细菌中介导 TMP 耐药的基因(dhfr)数量不断增多,尚未找到所有 dhfr 基因都相同的一致性序列。10.分枝杆菌中耐药性基因的检测用 PCR 方法检测出结核分枝杆菌 rpoB 基因位点的突变,可在分离培养出结核分枝杆菌前指导临床医生不能使用利福平治疗。katG 和 inhA 基因与异烟肼耐药相关,可通过 PCR-RFLP 分析和 PCR 产物的 DNA 序列分析来检测。七、联合抗菌药物敏感试验和体外杀菌试验10体外联合药敏试验的目的在于:①混合性感染时,单一用药可能不能控制各种病原体;②预防或推迟细菌抗生素耐药性的发生;③联合用药比单一用药时毒性小;④联合用药比单一用药时效果更好。抗菌药物联合用药有 4 种结果:①无关作用,两种药物联合作用的活性等于其单独活性;②拮抗作用,两种药物联合作用显著低于单独抗菌活性;③累加作用,两种药物联合作用时的活性等于两种单独抗菌活性之和;④协同作用,两种药物联合作用显著大于其单独作用的总和。协同作用是临床和实验室期盼的结果。协同用药最典型的例子是青霉素或其同类物与氨基糖苷类抗生素联合治疗肠球菌感染心内膜炎。尽管目前联合药敏试验较为费时费力,但当临床医生希望联合用药治疗时,必须做联合抗菌药物敏感性试验。(一)联合抑茵试验棋盘稀释法为目前临床实验室常用的定量方法,方法如下:1.首先,分别测定拟联合的抗菌药物对检测菌的 MIC。2.根据上述 MIC,确定药物稀释度。一般选 6~8 个稀释度,药物最高浓度为其 MIC 的2 倍,依次对倍稀释。两种药物的稀释分别在方阵的纵列和横列进行。这样可从管(孔)中得到不同浓度组合的两种药物混合液。3.接种菌量为 5×105CFU/ml,35℃孵育 18~24h 后观察结果。4.计算部分抑菌浓度(fractional inhibi-tory concentration,FIC)指数。FIC=(A 药联合时的 MIC/A 药单用时的 MIC)/(B 药联合时的 MIC/B 药单用时的 MIC)判断标准:FIC 指数&0.5 为协同作用;0.5~1 为相加作用;l~2 为无关作用;&2 为拮抗作用。(二)联合杀菌试验1.时间一杀菌曲线法采用杀菌动态曲线用于评价一种抗菌药物对测试菌的杀菌速率,也可评价两种及两种以上抗菌药物对测试菌联合杀菌活性。方法如下:(1)无菌试管标记为 Oh、4h、8h、24h 和生长对照五组。(2)每管加入肉汤培养基 lOml。(3)每管中加入定量的测试药物。(4)每管中加入 0.1m1 0.5 麦氏比浊度标准的菌液,使细菌终浓度为 106CFU/ml。(5)加入菌后,立即将 0h 管和生长对照管游涡混匀 15s,并用生理盐水稀释 1 000 倍。取出 0.1ml 涂布于血琼脂平板上,35℃孵育过夜后计数菌落数。(6)其他组试管按时培养后同法计算菌落数。(7)将各时间点测的平均菌落数在半对数坐标纸上绘制杀菌曲线图。读取杀菌速率。2.最低杀菌浓度测定最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration,MBC)是指能杀灭 99.9%以上测试菌量的最低药物浓度。由于影响杀菌的因素较多,某些菌株在体外可表现出对杀菌药物的耐受现象或反常效应,使 MBC 测定结果重复性差,并且难以确定杀菌播放器加载中，请稍候...
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抗菌药物敏感性试验及细节耐药检测 1抗菌药物敏感性试验与细节耐药性监测来源:检验医学在线
南网编辑 一、需氧菌及兼性厌氧菌的药物敏感试验(一)纸片琼脂扩散法纸片琼脂扩散法又称 Kirby-Bauer 试验,是操作最简易、使用最广泛的抗菌药物敏感性试验。1.试验原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的...
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