婴幼儿配方食品中生物素的高效液相色谱- 质谱联用测定 - 色谱世界
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- 婴幼儿配方食品中生物素的高效液相色谱- 质谱联用测定
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摘　要: 采用高效液相色谱- 质谱联用法测定了婴幼儿配方食品中生物素的含量。样品经前处理后以DikmaC18 (416 mm ×250 mm, 5μm)为色谱柱, 流动相为甲醇(含体积分数为015%甲酸) - 0102 mol?L - 1醋酸铵(含015%甲酸) (体积比40 ∶60)溶液, 柱温: 25 ℃, 进样量: 80μL, 流速为110 mL?min- 1 , 柱后分流比为1 ∶3 (体积比) 。在Agilent 1100 LC /MSD XCT离子阱质谱仪上, 以多离子反应监测(MRM)方式进行定量分析, 用于监测的离子为m / z 2。生物素在μg?L - 1范围内线性关系良好, 方法加标回收率为87%～101% ( n = 5) , 检出限为0135μg?L - 1 ; 方法的检出限为017 ng/g。结果表明, 该法操作简便、灵敏度高、重复性好, 将其用于婴幼儿配方食品中生物素的测定, 取得了良好的结果。
&&& 生物素( biotin)即维生素H或辅酶R, 是一种水溶性含硫维生素。生物素在自然界普遍存在于动植物组织内, 主要来源于酵母、花椰菜、坚果类、蛋黄、肝脏和肾脏。生物素在生物代谢中起着重要的作用, 当人体缺乏生物素时会产生精神疲乏、恶心、呕吐、贫血、鳞状皮炎等症状。人体肠道细菌可合成一些生物素, 因此人体极少缺乏生物素。但研究表明, 由于婴幼儿肠道功能较弱, 导致生物素缺乏而易引起舌炎和皮炎, 因此需在婴幼儿食品中强化生物素。
&&& 生物素的测定方法主要有微生物法[ 1 - 2 ] 、酶联免疫法[ 3 - 5 ] 、分光光度法[ 6 ] 、荧光分光光度法[ 7 - 8 ]和电化学法[ 9 ]等。其中微生物法最灵敏且应用最广泛; 荧光分析生物素是基于与生物素关联密切的灵敏的色氨酸荧光, 不适于生物性材料中的生物素检测, 因其所含色氨酸较高, 会干扰测定; 分光光度法仅限于含量高的样品; 色谱法[ 10 - 17 ]一般适用于药物等生物素含量较高产品的检测。这些方法或操作繁琐, 或灵敏度与准确度不高。婴幼儿配方食品成分复杂, 所添加的生物素含量极低, 一般为十几个微克/100克。基于高效液相色谱的分离能力和质谱的高灵敏度、高选择性, 本文研究了用高效液相色谱- 质谱联用测定婴幼儿配方食品中生物素的方法。方法简便、快速、选择性和重复性好, 结果准确可靠, 能满足婴幼儿配方食品分析的要求, 结果令人满意。
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色谱世界(www.chemalink.net)　版权所有　　　　　　　　化学发光法生物素检测试剂盒/Chemiluminescent Biotin-labeled Nucleic Acid Detection Kit
化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒
&产品编号: D3308
&产品包装: 1000cm2
&产品价格: 1078.00元
产品简介：
&&&&化学发光法生物素检测试剂盒(Chemiluminescent Biotin-labeled Nucleic Acid Detection Kit)是一种通过Streptavidin-HRP及后续的BeyoECL Plus试剂来实现化学发光检测Biotin标记核酸的检测试剂盒。适用于Southern blot、Northern blot、ribonuclease protection assay (RPA)或EMSA等实验中，采用生物素标记的DNA或RNA探针时的检测。本试剂盒不适用于生物素标记蛋白的检测。
&&&&本试剂盒同时还提供了封闭液、洗涤液等检测时所需的配套试剂。
&&&&本试剂盒采用了高质量的Streptavidin-HRP Conjugate，HRP和Streptavidin共价交联的比例大于3，这样比采用Streptavidin和Biotin-HRP conjugate两种试剂进行检测要更方便，并且灵敏度更高。
&&&&采用了非特异性结合比avidin更低的strepatavidin，使检测结果背景更低灵敏度更高。
&&&&本试剂盒没有提供生物素探针标记相关的试剂，生物素标记的DNA探针或EMSA探针的制备可以相应地使用碧云天生产的或。
&&&&本试剂盒可以用于检测至少10块10 x 10cm有生物素标记EMSA探针的膜，即共1000cm2。
包装清单：
BeyoECL Plus Reagent A
BeyoECL Plus Reagent B
Streptavidin-HRP Conjugate
洗涤液(5X)
检测平衡液
保存条件：
&&&&D3308-3&Streptavidin-HRP&Conjugate在-20℃保存，其余可4℃保存。如果长期不用，整个试剂盒可-20℃保存，-20℃可以保存更长时间。
注意事项：
&&&&需自备带正电荷尼龙膜，以及凝胶电泳时所需的相关试剂。可以向碧云天订购。
&&&&如果需要使用更多的封闭液或洗涤液，可另外单独订购或。
&&&&为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：
1. 在使用Biotin标记探针的情况下，完成Southern、Northern杂交及后续洗涤后，或RPA的转膜和交联
&&&后，或EMSA的转膜和交联后，可以使用本试剂盒开始检测。下面的检测过程中溶液的用量是用于一片
&&&10x10cm膜的量。如果膜较大或较小，各溶液的用量可以按比例放大或缩小。
2. 37-50℃水浴溶解封闭液和洗涤液。
&&&注意：封闭液和洗涤液必须完全溶解后方可使用，封闭液和洗涤液可以在室温至50℃之间使用，但
&&&必须确保这两种溶液中均无沉淀产生，在冬天需特别注意。
3. 取一合适的容器加入15ml封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢
&&&摇动15分钟。
4. 取7.5μl
Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封闭液中(1:2000稀释)，混匀备用。
5. 去除封闭液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封闭液。在侧摆摇床或水
&&&平摇床上缓慢摇动15分钟。
6. 取25ml 洗涤液(5X)，加入100ml重蒸水或MilliQ级纯水，混匀配制成125ml洗涤液。
7. 将尼龙膜转移至另一装有15-20ml洗涤液的容器内，漂洗1分钟。
8. 去除洗涤液，加入15-20ml洗涤液，在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟。
9. 重复步骤8三次(共洗涤四次)，每次洗涤时间均约为5分钟。
10. 将尼龙膜转移至另一装有20-25ml检测平衡液的容器内，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟。
11. 取5ml BeyoECL Plus Reagent A和5ml BeyoECL Plus Reagent B混匀，配制成BeyoECL Plus
&&&&Reagent工作液。注意：BeyoECL Plus Reagent工作液必须现配现用。说明：从本步骤起操作方法和
&&&&注意事项同Western实验的荧光检测。
12. 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器
&&&&内或保鲜膜上。
13. 在尼龙膜的表面小心加上步骤11配制好的共10ml BeyoECL Plus Reagent工作液，使工作液完全覆盖
&&&&尼龙膜。室温放置2-3分钟。
14. 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间，并固
&&&&定于压片暗盒(也称片夹)内。
15. 用X光片压片1-5分钟。可以先压片1分钟，立即显影定影，然后根据结果再调整压片时间；也可以直
&&&&接分别压片30秒、1、3、5分钟或更长时间，然后一起显影定影观察结果。
常见问题：
1. 背景较高。
&&&可能是由于封闭液或洗涤液中出现沉淀或混浊。解决方法是参考使用说明，加热封闭液和洗涤液使封
&&&闭液和洗涤液完全溶解。
2. 出现斑点状背景。
&&&可能是由于过长时间存放导致Streptavidin-HRP Conjugate中出现沉淀，解决方法是g离
&&&心1分钟再吸取近液面的Streptavidin-HRP Conjugate。转膜时有气泡也会导致斑点状背景产生，解
&&&决方法是转膜时胶、膜、滤纸之间确保没有气泡。
3. 没有条带或信号很弱。
&&&A. 探针标记效率太低，解决方法是检测探针标记效率，确保探针的标记效率较高。
&&&B. 探针用量不足或样品量不足，解决方法是加大探针用量或加大样品用量。
&&&C. 样品中待检测的核酸降解，解决方法是检测待检测的核酸样品是否出现降解，如降解则须制备新
&&&&&&的样品。
&&&D. 转膜效果不佳，解决方法是检查转膜的方法和步骤，最好使用预染的标准品作为转膜的对照。
&&&E. 选择了不适当的膜，尽管不少情况下硝酸纤维素膜也可以完成检测，请优先选择带正电荷的尼龙
&&&&&&膜。
&&&F. 检测过程中膜干掉了，解决方法是确保检测过程中膜可以被液体覆盖或始终保持湿润。
&&&G. 没有交联或交联效果不佳，解决方法是进行适当的交联，如果交联效果不佳则须检测交联的效
&&&&&&率。
&&&H. 洗涤液(5X)没有稀释就直接使用，请把洗涤液(5X)稀释至1X后再使用。
&&&I. X光片曝光时间不足，解决方法是适当延长曝光时间。
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使用本产品的文献：
1. Mao XM, Zhou Z, Cheng LY, Hou XP, Guan WJ, Li YQ.
&&&FEBS Lett. 2009 Oct 6;583(19):3145-50. Epub 2009 Sep 13.
2. Du YL, Shen XL, Yu P, Bai LQ, Li YQ.
&& Appl Environ Microbiol. ):8415-26.
3. Zhang P, Li ST, Liu TT, Fu CH, Zhou PP, Zhao CF, Yu LJ
&& PLANT CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE，（1），63-70
4. Li ST, Fu CH, Zhang M, Zhang Y, Xie S, Yu LY
&& PLANT MOLECULAR BIOLOGY REPORTER，October 2012, Volume 30, Issue 5, pp
5. Meng Q, Xiao Z, Yuan H, Xue F, Zhu Y, Zhou X, Yang B, Sun J, Meng B, Sun X, Cheng F.
&& Mol Biol Rep. ):1119-24.
6. Li F, Jiang Z, Wang K, Guo J, Hu G, Sun L, Wang T, Tang X, He L, Yao J, Wen D, Qin X,
&& Zhang L
&& Gene. 2012 Jul 25;503(2):200-7..【doc】常用生物素测定方法的简介介绍,简介,方法,常用的,doc,生物素,测定的,】常用..
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