复方补脾肾中药对环磷酰胺所致的造血抑制小鼠骨髓有核细胞、CFU-GM、CFU-F生成的影响--《时珍国药研究》1998年03期
复方补脾肾中药对环磷酰胺所致的造血抑制小鼠骨髓有核细胞、CFU-GM、CFU-F生成的影响
【摘要】：观察复方补脾肾中药补肾阴方和补肾阳方对造血抑制小鼠骨髓造血的影响。方法：以环磷酰胺（Ｃｙ）１２０ｍｇ／ｋｇ给昆明种小鼠连续腹腔注射３ｄ，造成骨髓抑制模型。以补肾阴方和补肾阳方连续灌胃１０ｄ。以骨髓有核细胞计数法计数骨髓有核细胞，以骨髓造血祖细胞培养方法培养粒单系祖细胞（ＣＦＵ－ＧＭ）和成纤维祖细胞（ＣＦＵ－Ｆ）。结果：两方均能提高骨髓有核细胞数和ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－Ｆ集落形成率，补肾阳方优于补肾阴方。
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：R285.5【正文快照】：
复方补脾肾中药对环磷酰胺所致的造血抑制小鼠骨髓有核细胞、ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－Ｆ生成的影响李振波①顾振东②黄文玉③①广州中医药大学１９９５级博士生，广州５１０４０７；②山东中医药大学附院，济南２５００１４③山东中医药大学免疫教研室，济南２５００１４提要
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ofChineseMedicine University 硕士学位论文 泰合胶囊补肾壮阳作用的实验研究 学位申请人 姚敏 专
名 称 方剂学 申请学位类型 医学硕士科学学位 指导教师姓名 顿宝生 论文提交日期 2008年4月 摘要 目的：通过建立肾阳虚动物模型来观察泰合胶囊是否具有补肾壮阳的作用。 ．
方法：采用文献中常用造模方法，分别进行以下实验：1．对去势大鼠的壮阳作用： 测定阴茎勃起潜伏期和阴茎勃起持续时间，计算包皮腺、精囊腺+前列腺、提肛肌的脏 器指数，采血取血清用放射免疫法测大鼠血清睾酮 T 及雌二醇 E2 水平。2．交配 实验：测定扑捉潜伏期、射精潜伏期、30min内雄鼠扑捉雌鼠的次数及射精次数、30min 内各组发生扑捉射精动物数的扑捉百分率和射精百分率。若30min内未出现扑捉或射 精时潜伏期均计为30min。3．对阳虚小鼠阳虚症状的保护作用：测肛温、自发活动、 上举次数、游泳时间，死亡后迅速剖取胸腺、肾上腺、脾脏、包皮腺、精囊腺前列腺、 睾丸、提肛肌，精确称重。4．对幼年雄性小鼠器官发育的影响：各组给药一定时间后 取心、肝、脾、睾丸、附睾、包皮腺、精囊腺前列腺、提肛肌，称湿重，计算脏器系 数。5．对小鼠血清溶血素含量的影响：记录吸收度值 OD ，样品的HC∞ 半数溶血’ 时的吸收度值
样品的吸收度值÷羊红细胞半数溶血时的吸收度值×稀释倍数。溶 血素水平以半数溶血值HC∞表示，各组数据以均值±标准差表示，组间进行t测验， 以检验药物的作用。6．对小鼠免疫器官重量及体内碳粒扩清作用的影响：测定光密度 OD；称取肝脏、脾脏、胸腺重量；计算廓清指数K[k
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补肾益精中药在干细胞研究中的应用进展
作者：童晓云，杨忠奇，冼绍祥，赵立诚&&&&作者单位：广州中医药大学2008届博士研究生，广东 广州
510405；广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州
干细胞研究是目前国内外科学界关注研究的热点领域，文章回顾了补肾益精中药促进干细胞向成骨细胞、造血细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、神经细胞、肝细胞及生殖细胞等多方面增殖分化的研究，为干细胞的研究提供了新的思路。
【关键词】& 补肾益精中药 干细胞 分化
干细胞研究是近些年来国内外科学界关注的热点领域，由于干细胞具有多向分化及自我增殖的能力，故在细胞替代治疗、基因治疗、组织工程等方面具有良好的应用前景。祖国医学认为：肾藏精主生殖，肾主骨生髓化血通于脑，肾精的盛衰决定着人体的生长、发育与生殖。由于肾精在内涵及功能上与干细胞有相似之处，目前相关的大量研究表明，许多补肾益精中药可促进骨髓造血干细胞增殖分化，并可促进成骨细胞、血管内皮细胞、神经细胞、肝细胞及生殖细胞等的再生，故加强补肾益精的研究可望为干细胞开创新的治疗途径。现将补肾益精中药在干细胞研究中的应用进展综述如下。
1& 肾精与干细胞的相似性
祖国医学认为，精是生命的根源物质，精气藏于肾。《素问&六节脏象论》说：&肾者，主蛰，封藏之本，精之处也。&《素问&金匮真言论》曰：&夫精者，身之本也&。肾中所藏之精可分先天之精与后天之精，其中，人出生之前，在母体中所获得者为先天之精。《灵枢&本神》所说：&生之来，谓之精。&《灵枢&阴阳脉解》说：&两神相搏，合而成形，常先身先，是谓精。&《灵枢&经脉》：&人始生，先成精，精成而脑髓生，骨为干，脉为营，筋为刚，肉为墙，皮肤坚而毛发长。&论述了胚胎的形成、发育的过程，认为精是形成胚胎、构成人形的原始物质。这种先天之精来源于父母的生殖之精-即精子和卵子结合后的受精卵，受精卵作为全能干细胞，是构成胚胎发育的原始物质，在母腹内促使胎儿形成并发育完善，故先天之精在含义上与胚胎干细胞是极为相似的。
此外，精不仅是构成人体的基本物质，也是人体生长发育及各种功能活动的物质基础。出生之后，通过肺吸入之清气，脾胃吸收之水谷精气，不断化生为后天之精。后天之精能推动促进机体的生长、发育和生殖，并调节人体的各种生理功能活动。这种&精&的特点是能化，如《素问&阴阳应象大论》所云：&气归精、精归化&，所谓化就是能化生出身体的各种脏器组织及气血津液等所有成分，故具有再生的信息。因此，从中医学的眼光看，中医所言的&精&与多潜能干细胞在内涵与功能上具有很大的相关性［1］。因此，通过补肾益精治疗，有可能通过促进干细胞的增殖分化能力，从而达到修复再生器官、恢复器官功能细胞的作用。
2& 补肾益精中药促进骨髓干细胞增殖分化的研究
中医学很早就认识到肾与骨髓关系密切，《黄帝内经》曰：&肾藏精，主骨生髓&&骨者，髓之府&&髓者，骨之充也&&肾生骨髓&。
2.1& 补肾益精中药促进骨髓干细胞向成骨细胞分化根据补肾益精中药具有生髓壮骨功效的理论，国内许多学者通过大量动物实验与临床实践均发现，补肾类中药能促进骨髓干细胞向成骨细胞的增殖分化。
陈薇等［2］研究发现，中药龟版提取物浸膏洗脱后的组分具有促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖的作用。郑良朴等［3］观察不同浓度的补骨合剂（补肾壮骨汤基础化裁）对体外培养骨髓间充质干细胞（MSCs）分化的影响，发现补骨合剂可以促进MSCs分泌碱性磷酸酶和骨钙素，从而加速MSCs向成骨细胞分化。王和鸣等［4］研究巴戟天对骨髓基质细胞向成骨细胞分化的影响，结果发现，巴戟天水提物及醇提物均能促进含药血清法体外培养的骨髓基质细胞向成骨细胞分化，且巴戟天醇提物的作用强于水提物。曾意荣等［5］观察补肾活血中药（由熟地、杜仲、补骨脂、川牛膝、木瓜、枸杞子、丹参、广木香等组成）含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖的作用，结果发现补肾活血中药含药血清能对大鼠MSCs在体外增殖能力有促进作用。马慧萍等［6］将淫羊藿总黄酮（TFE）和含TFE的大鼠血清加入大鼠MSCs培养液中，进行细胞增殖和成骨性分化的分析，结果表明TFE活性代谢产物强烈刺激MSCs的增殖和成骨性分化。肖鲁伟等［7］观察复方右归饮含药血清对胎兔骨髓基质细胞体外培养的增殖及向软骨细胞诱导分化的影响，结果发现，不同浓度右归饮含药血清对培养骨髓基质细胞均显示增殖刺激作用，右归饮含药血清诱导后细胞形态由原先的长梭形、纺锤形逐渐变为圆形、椭圆形，Ⅱ型胶原免疫组化染色显示呈现阳性，表明右归饮可诱导骨髓基质细胞定向分化为软骨细胞。
以上这些研究提示中药可以促进骨髓干细胞向成骨方向分化，从而在治疗骨质疏松症、骨缺损疾病方面，或在骨组织工程研究中具有很大的应用前景。
2.2& 补肾益精中药促进骨髓造血干/祖细胞的增殖分化精血同源，肾与血液的生成有着极为重要的关系，精血可相互滋生转化，肾中所藏的先天之精不仅可以化生为肾气，也能够化生为血液。《张氏医通》云：&血之源头在乎肾&。张景岳在《景岳全书&血证》亦曰：&血即精之类也&。《侣山堂类辨》：&肾为水脏，主藏精而化血&。故通过补肾固精的中药治疗，有可能起到生髓化血的作用。
国内不少学者根据以上理论开展中医药对骨髓造血干/祖细胞生物学的研究由来已久，通过采用多种骨髓损伤的动物模型进行补肾生髓化血的实验研究，并在治疗血液病、放化疗后骨髓抑制等方面进行了大量相关的临床观察，结果表明，补肾生髓中药有保护骨髓、促进造血的作用。
如张荣华等［8］发现补肾活血方（当归、丹参、仙灵脾、骨碎补等）对免疫介导的再障小鼠骨髓CD45+细胞、骨髓有核细胞有保护作用，其机理可能是补肾活血中药能促进骨髓干细胞的增殖分化。张新华等［9］发现益髓生血灵（含熟地、山萸肉、当归、鸡血藤、砂仁、补骨脂、黄芪、党参、龟版胶及阿胶等）对小鼠骨髓粒-巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（BFU-E）和红系集落形成单位（CFU-E）均有促进增殖分化作用。陈志雄等［10］研究活髓片（黄芪、当归、川芎、补骨脂等）对环磷酰胺造模小鼠骨髓DNA影响，发现补肾活血中药方可以促进骨髓细胞由G1期进入S期，保护骨髓和促进骨髓细胞的DNA合成。梁毅等［11］研究发现，活髓片对免疫介导再障小鼠骨髓造血微环境紊乱状态有改善作用，可降低骨髓基质细胞凋亡率，促进培养细胞的血管细胞黏附分子（vascular cell adhesion molecule，VCAM-1）的表达，增加骨髓基质细胞的增殖能力。上述诸多研究证实了肾精充足，髓海充盈，则可促进骨髓的造血功能。
2.3& 补肾益精中药促进心肌细胞及血管内皮细胞的分化有学者对补肾益精中药在心血管系统再生修复方面的应用有所报道，如朱丹燕等［12，13］研究了淫羊藿苷诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化的作用，结果发现，10-7 mol/L淫羊藿苷可体外诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞，分化的心肌细胞经免疫荧光染色后，心脏&-辅肌动蛋白、肌钙蛋白T呈阳性。血管生成属于中医&血&&脉&理论范畴，&脉为血之府&，现代医学认为来源于骨髓的内皮祖细胞参与胚胎期及出生后血管的新生与修复，与祖国医学&肾主骨藏精、精血同源&理论有相通之处。王蕾等［14］通过免疫组化的方法观察补肾生血药（熟地、山茱萸、黄芪、阿胶等）对老年金黄地鼠子宫组织血管生成因子碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）表达水平的影响，结果表明补肾生血药能够明显改善老龄动物的生理性肾虚症状, 且促进局部血管生成。张树成等［15～17］研究补肾生血方(山茱萸、熟地黄、龟甲胶、阿胶、当归等)和补肾调经方(当归、熟地黄、菟丝子、枸杞子、五灵脂等)对老年雌性金黄地鼠（符合老年生理性肾虚症状）的促血管再生作用，发现这两个方药均具促进子宫组织血管生成作用，提示补肾中药具有整体促血管新生作用。并采用自身对照方法，对服用补肾调经中药前后的人治疗前后着床期子宫内膜组织的VEGF、VEGF受体（VEGFR）、bFGF/FGF、血小板衍化生长因子受体-&（PDGFR-&）、表皮生长因子受体（EGFR）进行免疫组化的对比分析，结果发现服用中药后5种血管生成因子的表达强度和阳性细胞率均明显增加，提示中药具有整体促进血管生成的作用，并进而提出&补肾生脉&说。
由上可见，补益肾精治疗可促使骨髓干细胞向成骨细胞分化，并可促进骨髓造血干/祖细胞、心肌细胞、内皮祖细胞等的增殖分化能力，揭示了&肾主骨生髓化血&的科学内涵。
3& 补肾益精中药促进神经细胞再生
肾主骨生髓，而&脑为髓之海&（《灵枢&海论》），&髓者，以脑为主&（《素问&奇病论》），&人始生，先成精，精成而脑髓生&(《灵枢&经脉》)，所以脑和髓的名称虽然不同，而实际上是同出肾精一源的，肾精是脑髓形成的物质基础，肾精充足则脑髓充盈，人体便精力旺盛，智慧灵活；肾精不足脑髓空虚，导致记忆力、智力下降。《灵枢&海论》曰：&髓海不足，则脑转耳鸣，胫酸眩冒，目无所见，懈怠安卧。&补肾益精中药改善记忆力减退、反应迟钝、思维丧失、神志呆钝等症状的功能已被很多实验证实，多种中医脑病如痴呆、中风后遗症、小儿脑瘫、儿童智力低下、脑萎缩等均表现出脑髓虚损的证候, 由于肾精亏损是直接原因，故均可从肾论治，通过补肾填精、充髓益智以治本［18］。
国内有不少学者根据祖国医学&肾藏精生髓通脑&的理论，开展了补肾益精中药诱导骨髓干细胞向神经细胞分化的研究，如张进等［19］观察发现龟版水煎液可体外诱导分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞转分化为神经干细胞，但未能被诱导为神经元样细胞与星形胶质细胞。陈东风等［20］观察龟版含药血清体外诱导成鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元的能力，结果发现成年大鼠骨髓间充质干细胞受龟版血清诱导后神经元样细胞NF表达阳性，且阳性表达达到高峰，故认为补肾中药龟版可减轻神经损伤症状，并对局灶性脑缺血后神经干细胞有促进增殖作用。高唱等［21］研究左归丸（主要成分为熟地黄、怀山药、枸杞子、山茱萸、菟丝子、牛膝、鹿角胶、龟版胶等）对分离培养乳鼠神经干细胞增殖分化的作用，发现左归丸可部分拮抗左旋单钠谷氨酸对神经干细胞的抑制作用，显著增加Nestin阳性细胞的比率。蔡光先等［22］探讨地黄多糖对骨髓间充质干细胞分化为神经细胞的诱导效应，地黄多糖组经地黄多糖诱导培养24 h后细胞显示为典型的神经细胞样形态，神经丝蛋白与胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数均明显高于&-巯基乙醇组，而对照组神经丝蛋白及胶质纤维酸性蛋白染色均为阴性。因此认为，地黄多糖具有诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的作用。
故目前的研究结果表明，补益肾精治疗可促使骨髓干细胞向神经样细胞分化，揭示出&肾藏精生髓通脑&的科学内涵。
4& 补肾益精中药促进肝细胞再生
祖国医学历来有&肝肾同源&之说，《素问&阴阳应象大论》云：&肾生骨髓, 髓生肝&，生理上，肝肾同居下焦。肝血肾精同化于水谷精微，肾精可以化生肝血，肝血可以化养肾精。病理上亦会相互影响，肾精亏损，最易导致肝血不足；肝血不足，也可引起肾精亏损。
国内李瀚旻等［23，24］根据该理论采用骨髓形成肝细胞动物模型对比观察左归丸对实验小鼠骨髓形成肝细胞的影响，结果发现左归丸能够促进骨髓形成肝细胞，并认为，补肾促进骨髓形成肝细胞的作用机制可能在于调节全身机能和改善肝脏微环境，有利于骨髓细胞移行至肝脏并转化为肝细胞。他们以左归丸治疗经左旋谷氨酸单钠皮下注射结合肝大部切除复制肝肾精血亏虚证动物模型后，结果发现，左归丸在改善模型动物肝再生过程的同时，还可促进模型动物骨髓有核细胞增生，升高外周血红细胞和血红蛋白。卓勤等［25］观察了补肾益精药物益肾宝及左归饮对老年小鼠肝细胞DNA双链结构及损伤修复能力的影响，结果发现，老年小鼠肝细胞DNA的融解温度（Tm）及热增色效应较青年小鼠显著升高，服用补肾益精药物后其Tm及热增色效应明显降低，表明补肾益精药物可以减少老年小鼠肝DNA损伤程度，提高其损伤修复能力，改善其DNA结构的增龄性变化。
由上可见，补肾益精中药具有促进肝细胞再生的作用，上述研究证实了中医学肾与肝的密切联系。
5& 补肾益精中药促进生殖细胞再生
肾主生殖，天癸是由肾精产生的精微物质，具生殖功能。《类经》云：&天癸者，&&人之既生，则此气化于吾身，是为后天之元气。第气之初生，真阴甚微及其既盛，精血乃旺。故女必二七，男必二八而后天癸至，天癸既至，在女子则月事以时下，在男子则精气溢泻，盖必阴气足而后精血化耳。&天癸，在女子为血，男子则为精，其源头在肾。通过补益肾精治疗，可起到调节改善人体生殖功能的作用。
张树成等［26］观察两例放疗后致无精子不育的精原细胞瘤病例，予服用补肾生精中药治疗后（含菟丝子、女贞子、五味子、韭菜子、生地、首乌、党参、白花蛇舌草、蜈蚣、水蛭等），发现患者由无精、偶见精子到具有接近正常的精液质量表现，故提出中药在明确的生精作用中可能具有尚未引起重视的对生精干细胞的直接作用，首次提出中药对生精干细胞可能具有诱导或促分化的作用。
6& 结语
传统中医学认为，人是有机的整体，天人合一、顺应自然，强调整体观念，只要顺应人体生命规律，自然地充分发挥机体固有机能，就有可能再生修复到病损以前的状态。肾中所藏精气，是生命的基础与动力，是脏腑阴阳的根本，只有肾精充足，才能维持各种正常的生理活动。&精气夺则虚&，肾精亏虚可导致脏腑功能的不足，故可采取&虚者补之&&损者益之&&形不足者，温之以气，精不足者，补之以味&等方法，通过补肾益精法扶持调整脏腑本来具有的机能，同时也启发或者刺激脏腑潜在机能的一面。这种重视人体先后天精气、利用人体自身内在的再生修复能力、通过&扶正&而&祛邪&的中医学理论与目前利用干细胞达到再生修复作用的方法是相通的，且更为简便易行。
通过上述研究的结果，我们相信，随着干细胞研究方法的不断改进和对中医肾精理论认识的不断深入，将会进一步促进补肾益精中药干预干细胞分化的研究，并具有重要的临床意义和广阔的应用前景。
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