山东鸡新城疫病毒分离鉴定与Ⅱ+Ⅶ基因型灭活疫苗研究--《南京农业大学》2009年博士论文
山东鸡新城疫病毒分离鉴定与Ⅱ+Ⅶ基因型灭活疫苗研究
【摘要】：近年来,我国新城疫(Newcastle disease, ND)的流行日益复杂,免疫失败屡屡发生,给养禽业,特别是养鸡业造成了不可估量的经济损失。为更好地防制新城疫的发生,探索有效的防制措施,本研究对山东省鸡新城疫进行了流行病学调查,掌握了新城疫的流行状况,并分离获得了12个新城疫病毒流行株。在此基础上,对新城疫病毒LY1分离毒株的致病性及变异性状开展了检测分析,然后以此分离株制备灭活疫苗进行免疫保护试验,同时,构建了新城疫病毒HN基因C3dP29补体融合基因疫苗,探明了C3d P29基因的分子佐剂效果,为新城疫防制奠定了重要基础。主要研究包括以下4个部分：
1.NDV的分离鉴定与生物学特性研究
从山东省8个地区22个养禽场82份疑似新城疫病料中,分离和鉴定出12株NDV。将12株NDV进行了MDT、ICPI和IVPI检测,结果表明,6个分离株(WF10、WF13、LY1、LY7、ZB10和JN2株)MDT均小于60h、ICPI均大于1.6、IVPI均在2.00以上,表明为强毒株；DY2、LC3和BZ7株的MDT分别为63.6h、69.6h和62.4h, ICPI值为1.4、1.44和1.35,IVPI值为1.74、1.85和1.49,为中毒力毒株；WF3、LY14和TA6株为弱毒株。经动物回归试验,各毒株NDV均可导致鸡发生不同程度的发病和死亡,且发病和死亡的鸡均出现ND典型症状和剖检变化。
2. NDV LY1株F和HN基因的克隆与序列分析
利用RT-PCR技术,对山东省新城疫病毒LY1分离株的F基因主要功能区片断和HN基因全部的核苷酸序列进行了克隆和序列分析。结果显示：(1)LY1株F基因开放性阅读框架(ORF)为1662bp,编码489个氨基酸。与国内外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相同序列进行比较,该毒株F基因核苷酸序列的同源性在84.1%～88.7%之间,氨基酸同源性在88.1%～93.3%之间；F蛋白裂解位点区(112-117)氨基酸组成与强毒株一致。从分子水平证明NDV山东分离株(LY1)为新城疫强毒株。LY1株病毒在101位和121位分别为K(赖氨酸)、V(缬氨酸)两种特征氨基酸,具有Ⅶ型基因型NDV的典型特征。该毒株与我国标准毒株的同源性较低,与强毒株F48E9的同源性只有86.3%,与新城疫标准弱毒株C30的同源性只有84.2%,说明已发生一定的变异,这可能是高抗体水平压力下引起鸡群发病的原因。(2)HN基因ORF大小为1716bp,编码571个氨基酸。与国内外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相同序列进行比较,HN基因核苷酸序列的同源性在82.1%～87.4%之间,氨基酸同源性在87.6%～90.9%之间,属于强毒的C群,这与该病毒生物学鉴定的结论是一致的。
3.新城疫病毒不同基因型灭活油乳疫苗的研制及免疫效果测定
将新城疫病毒基因Ⅶ型LY1分离株和传统的LaSota株(基因Ⅱ型)与油佐剂按1：3比例混合乳化,分别制成油包水型LY1分离株、LY1分离株+LaSota株油乳剂灭活苗；无菌试验和物理性状检验合格；鸡体倍量注射试验结果证明疫苗安全性好；用LaSota株抗原进行HI试验,检测免疫接种鸡抗NDV-HI抗体,结果显示,LY1分离株+LaSota株油乳剂灭活苗于接种后的14d、21d、28d所产生的平均HI抗体效价与商品化灭活疫苗(LaSota株)无明显差异(P0.05),至35d后两种疫苗的抗体效价均达到7.2Log2以上；而LY1分离株灭活疫苗组各个时期(接种后7天除外)所产生的平均HI抗体效价与LY1分离株+LaSota株油乳剂灭活苗组及商品化灭活疫苗(LaSota株)组的抗体效价差异显著(P0.05)。LY1分离株+LaSota株油乳剂灭活苗组、LY1分离株灭活疫苗组和商品化灭活疫苗(LaSota株)组HI抗体效价上升规律相同,均与对照组各个时段所产生的平均HI抗体效价差异均极显著(P0.01)。免疫后4周用LY1分离株进行了攻毒试验。结果证明,LY1分离株+LaSota株油乳剂灭活苗组免疫保护率可达100%,LY1分离株灭活疫苗组和商品化灭活疫苗(LaSota株)组的免疫保护率分别为90%和70%。表明单纯使用LaSota株商品化灭活疫苗产生的保护力较低,而用分离株配以LaSota株制备的不同基因型(基因Ⅱ型+基因Ⅶ型)灭活油乳疫苗则能产生较强的保护能力。
4.鸡C3d分子佐剂-NDVHN基因疫苗的构建与免疫保护效果研究
以RT-PCR扩增新城疫病毒LY1株的HN基因,定向克隆至真核表达载体pCDNA-P29n中P29n的上游,将鸡补体C3d的受体结合功能区P29作为分子佐剂与新城疫病毒的HN基因连接,构建了NDVpCDNA-HN-P29.4和pCDNA-HN-P29.6分子佐剂基因疫苗,免疫接种3周龄SPF鸡,结果显示,免疫后3-4周pCDNA-HN-P29.4、pCDNA-HN-P29.6和pCDNA-HN免疫组均能诱导鸡体产生HI抗体,但pCDNA-HN-P29.4、pCDNA-HN-P29.6免疫组HI抗体水平明显高于pCDNA-HN免疫组(P0.01),但低于商品化灭活苗免疫组。攻毒试验结果表明,pCDNA-HN-P29.6和商品化灭活苗免疫组能够较好地抵抗致死量病毒的攻击,保护效率达90%,明显高于pCDNA-HN免疫组,表明鸡C3d分子对NDV-HN基因具有明显协同作用。该研究结果为进一步研究开发和利用鸡C3d奠定了基础。
【关键词】：
【学位授予单位】：南京农业大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2009【分类号】：S858.31【目录】：
摘要9-11ABSTRACT11-14符号及缩略语14-16第一篇 文献综述16-66 第一章 新城疫的流行概况及研究进展16-42
1 新城疫的流行概况16-18
2 病原学研究进展18-26
2.1 病毒的分类与理化特性18-19
2.2 生物学特性19
2.3 抗原性19-20
2.4 NDV的毒力和致病性20-21
2.5 NDV的分子生物学特性21-25
2.5.1 NDV基因组组成21
2.5.2 NDV结构蛋白分布及特征21-25
2.6 致病性的分子基础25-26
3 ND诊断技术的研究进展26-30
3.1 单克隆抗体技术27-28
3.2 核酸探针技术28
3.3 限制性核酸内切酶分析28-29
3.4 RT-PCR技术29-30
4 ND防制方法的研究进展30-35
4.1 鸡新城疫灭活疫苗30
4.2 鸡新城疫活疫苗30-31
4.3 鸡新城疫基因工程苗31-35
4.3.1 亚单位疫苗31-32
4.3.2 DNA疫苗32-33
4.3.3 重组活载体疫苗33-35
参考文献35-42 第二章 核酸疫苗及免疫佐剂的研究及应用42-66
1 核酸疫苗的研究进展42-53
1.1 核酸疫苗的结构43
1.2 核酸疫苗的作用机理43-46
1.3 核酸疫苗的优点及不足46-49
1.3.1 核酸疫苗的优点46-48
1.3.2 核酸疫苗的不足48-49
1.4 影响核酸疫苗免疫效果的主要因素49-52
1.4.1 目的基因的选择49
1.4.2 质粒载体的选择49-50
1.4.3 免疫剂量及次数50
1.4.4 免疫方法与途径50-51
1.4.5 免疫增强剂和免疫佐剂的应用51
1.4.6 接种前组织预处理51-52
1.5 增强DNA疫苗免疫效果的策略52-53
2 DNA疫苗免疫佐剂的研究与应用53-59
2.1 细胞因子佐剂53
2.2 CpG DNA(ODN)佐剂53-54
2.3 补体分子佐剂C3d54-59
2.3.1 C3d的分子生物学特性55
2.3.2 C3d的分子佐剂作用55-57
2.3.3 C3d可能的作用机制57-59
3 本研究的目的及意义59-60
参考文献60-66第二篇 实验研究66-126 第三章 NDV的分离鉴定与生物学特性研究66-78
1 材料与方法66-69
1.1 材料66-67
1.1.1 新城疫标准毒株66
1.1.2 标准血清66-67
1.1.3 SPF鸡和鸡胚67
1.1.4 病料67
1.1.5 试剂67
1.1.6 主要仪器67
1.2 方法67-69
1.2.1 病料的来源67
1.2.2 病毒的分离与增殖67-68
1.2.3 病毒分离株的鉴定68
1.2.4 分离株毒力测定68-69
1.2.5 动物回归试验69
1.2.6 新城疫鸡群的平均抗体效价测定69
2 结果69-73
2.1 临床症状与流行特点69
2.2 病毒的分离69
2.3 病毒分离株的鉴定69-71
2.3.1 HA和HI试验69-70
2.3.2 血凝谱测定70-71
2.4 分离株毒力测定71
2.5 动物回归试验71-73
2.6 新城疫鸡群的平均抗体效价测定结果73
3 讨论73-75
参考文献75-78 第四章 山东省新城疫病毒LY1分离株F与HN基因序列分析78-104
1 材料与方法79-88
1.1 材料79-81
1.1.1 SPF鸡胚79
1.1.2 菌株与质粒载体79
1.1.3 病毒79
1.1.4 试剂79
1.1.5 溶液配制79-81
1.1.6 主要仪器、设备81
1.2 方法81-88
1.2.1 NDV LY1株增殖与浓缩81
1.2.2 病毒RNA的提取81-82
1.2.3 NDV F基因和HN基因的的RT-PCR扩增82-84
1.2.4 琼脂糖凝胶电泳分析84
1.2.5 PCR产物的回收84-85
1.2.6 NDV F基因和HN基因的克隆与鉴定85-86
1.2.7 重组质粒的提取与鉴定86-88
1.2.8 阳性质粒测序与序列分析88
2 结果88-100
2.1 F和HN基因的RT-PCR扩增结果88-89
2.1.1 F基因的RT-PCR扩增结果88-89
2.1.2 HN基因的RT-PCR扩增结果89
2.2 F基因、HN基因的克隆及阳性克隆的鉴定结果89-91
2.2.1 F基因的克隆及阳性克隆的鉴定89
2.2.2 HN基因的克隆及阳性克隆的鉴定89-91
2.3 F基因和HN基因的克隆测序及序列分析比较91-95
2.3.1 F基因的克隆测序及序列分析比较91-93
2.3.2 HN基因的克隆测序及序列分析比较93-95
2.4 与国内外标准株同源性分析比较95-97
2.5 对新城疫山东分离株(LY1)F蛋白裂解位点区(112～117)的研究97-98
2.6 系统发育进化树98-100
2.6.1 F基因发育进化树98-99
2.6.2 HN基因发育进化树99-100
3 讨论100-102
参考文献102-104 第五章 新城疫不同基因型灭活油乳疫苗的研制及免疫效果测定104-114
1 材料与方法105-107
1.1 材料105
1.1.1 种毒105
1.1.2 试验用鸡胚和鸡105
1.1.3 1%红细胞悬液105
1.1.4 主要试剂105
1.1.5 主要仪器105
1.2 方法105-107
1.2.1 LY1株半数致死量(LD_(50))测定105
1.2.2 新城疫病毒油乳剂灭活疫苗的制备105-106
1.2.3 疫苗质量的检验106
1.2.4 免疫效果试验106-107
1.2.5 攻毒保护试验107
2 结果107-109
2.1 LY1株半数致死量(LD_(50))测定结果107
2.2 疫苗质量检验结果107-108
2.2.1 物理性状107
2.2.2 无菌试验107-108
2.2.3 安全性试验结果108
2.3 免疫效果试验结果108-109
2.4 攻毒保护试验结果109
3 讨论109-112
参考文献112-114 第六章 鸡C3d分子佐剂NDV HN基因疫苗效果研究114-126
1 材料与方法115-118
1.1 材料115
1.2 方法115-118
1.2.1 RT-PCR扩增NDV-HN基因115
1.2.2 C3d-P29-HN融合基因重组质粒的构建115-117
1.2.3 重组质粒的大量提取117-118
1.2.4 NDV C3d-P29 HN基因疫苗免疫抗体效价检测118
1.2.5 攻毒保护试验118
2 结果118-121
2.1 RT-PCR扩增新城疫LY1株HN基因118-119
2.2 抗原基因的插入119-120
2.3 血凝抑制抗体变化120
2.4 攻毒保护试验结果120-121
3 讨论121-122
参考文献122-126全文总结126-128攻读学位期间发表的学术论文128-130致谢130
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丁东;[D];昆明医科大学;2013年
赵文双;[D];内蒙古农业大学;2001年
陈燕;[D];湖南师范大学;2006年
赵光辉;[D];东北农业大学;2009年
张明;[D];西北农林科技大学;2005年
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京公网安备74号乙肝大HBV-DNA7.275E+5,我想问具体怎么治疗？乙肝大三阳_百度知道
乙肝大HBV-DNA7.275E+5,我想问具体怎么治疗？乙肝大三阳
病情描述（发病时间、主要症状、就诊医院等）：具体是在2009年9月份体检时查出患了乙肝大三阳，当时再去具体检查后发现HBV-DNA是1.45E+6，然后医生开给我了阿德福韦和甘草酸肠溶胶囊，断断续续吃了 1个月，倒2010年2月底去检查肝功能都好了，HBV-DNA是6.912E+5，然后又配了1个月的药（跟上次配的一样），吃完了，号检查HBV-DNA是7.275E+5,ALT:42(0-50);AST:35(0-50);ALP:64(20-130);GGT:22(0-50);TP:73.7(60-83);ALB:44.6(35-55);TBIL:16(2-22);DBIL:3.5(0-7);IBIL:12.5(2-20);XTBA:3.1(0-12),也就是说肝功能都正常了。就诊医院是海宁市人民医院曾经治疗情况和效果：想得到怎样的帮助：我想知道的是我应该继续吃阿德福韦和甘草酸肠溶胶囊吗？？
提问者采纳
继续服用阿德福韦酯，服用的12个月时评介疗效，如不佳可考虑换用恩替卡韦。作好长期及至于终生服用的思想和经济的准备。（钟备大夫郑重提醒：因不能面诊患者，无法全面了解病情，以上建议仅供参考，具体诊疗请一定到医院在医生指导下进行！）清远市人民医院钟备
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怎么治疗乙肝病，慢性隐匿性乙肝”的隐匿性不但表现在如疲倦、消瘦、发黄等病症不明显，重要的是在乙肝血液“二对半”检查的结果中也表现不明显。有的患者在检测血清“二对半”时，发现表面抗原(HbsAg)阴性，仅表面抗体(抗-HBs)、核心抗体(抗-HBc)和(或)e抗体(抗-HBe)阳性;甚至有的患者5项结果(包括2项抗原和3项抗体)全部阴性，但HBVDNA结果阳性,转氨酶高。所以现在确诊慢性乙肝不但需要依据乙肝血液“二对半”的检查结果，更需要HBVDNA的检测结果。“二对半”是常用的乙肝病毒血清标志的俗称，通过“二对半”检测可以间接了解乙肝病毒的存在和复制的情况，但是它们无法精确反映病毒数量和病情的变化。而检测HBVDNA则是通过检测病毒的核酸直接准确地检测乙肝病毒的活动。 iH0i9
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