所谓的T。B注射器是什么样的啊？

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2011-12-05 13:59 标签： B/L

实验中常需要从淋巴细胞群中分離出单一的T细胞或细胞以便更深入地研究T,细胞的生物学特性和功能。目前常用的分离方法有免疫磁珠分离法和免疫吸附法近年来应用鋶式细胞仪可以分离出均质性的单一细胞类型或亚群。

（一）免疫磁珠法分离T细胞和细胞

用特异性抗T细胞单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠（immunomangnetic eads)这种免疫磁珠可于磁场中结合淋巴细胞悬液中的T细胞，而未结合的细胞和其他细胞被洗脱下来免疫磁珠法分离细胞具有纯度高（一般为95％～99%）的特点。其分离效果可媲美流式细胞仪并具有比流式细胞仪分离术经济、方便省时、简单快速等优点。

2．磁性激活细胞汾离器（MACS) MACS柱（C型可结合2x108个细胞）；

3．生物素标记的磁性微珠；

4．生物素标记的抗CD4和抗CD8单克隆抗体及生物素标记的羊抗鼠IgG F(Fa)2;

5. MACS柱染色洗涤液、MACS柱洗脱液（含1％牛血清清蛋白的PS)和MACS柱；FITC标记的亲和素；

6．培养液及试剂 RPMI 1640细胞培养液，浸湿液（含10％牛血清清蛋白的PS)

1．新MACS柱需高温高压灭菌，烘干后备用将C型MACS柱内分别用10ml注射器在柱下三通阀门处加入10ml MACS柱浸湿液，使液面达到柱内铁丝基质平面上2～3cm处关闭柱下三道阀门备用。

5分钟）重新悬浮于0.15m1 MACS染色洗涤液中，加入生物素标记的磁性微珠（比例为5ul/108个细胞）冰浴孵育5～10分钟。然后加入3m1 MACS柱洗脱液

3．将MACS柱放入MACS磁铁槽内，用20ml MACS柱洗脱液洗柱待液体降至柱内铁丝基质平面上2～3cm处，关闭三通阀门将细胞悬液置于MACS柱内。在柱下放一支50ml的试管打开阀門，使其流速为3～5m1/min边流边加MACS柱洗脱液，每个柱内至少加柱洗脱液30ml试管内的洗脱液中为CD4-CD8-细胞（即阴性分离）。离心洗涤后调整细胞至所需浓度备用

将MACS柱移出磁场外，用MACS柱洗脱液洗柱（较大流速）则该洗脱液中为CD4-,CD8+或CD4+CD8+细胞（即阳性分离）。离心洗涤后调整细胞至所需浓度備用为了进一步提高细胞分离纯度，可再用另外两个MACS柱重复上述过柱过程并用流式细胞仪进行分析测定

1. MACS柱用完毕后需立即用双蒸水冲洗干净，再以20倍于柱体积的无菌双蒸水和5倍于柱体积的95％溶液洗涤37℃下烘干，高压灭菌以备再次使用

2．不要将大团细胞加入柱内，以免造成堵塞进而毁坏MACS柱

3．洗脱MACS柱时，流速越慢则分离细胞的纯度越高在MACS柱上加入液体时不要产生气泡。

4．在分离洗脱时柱内液体不偠低于柱内的铁丝基质平面以下，即始终让铁丝基质内含有液体否则细胞分离将完全失败。

5．如果分选的细胞还需要进行培养所有的器材和液体均应无菌。MACS分离过程应在超净工作台内完成操作

（二）用尼龙毛柱分离T细胞和细胞

尼龙毛柱的制备（注意无菌操作）：

1．取矗径3D，长度约10cm的尼龙毛（聚酞胺纤维）用0.2mo1/L HCl浸泡过夜，用双蒸水洗净HCl置37℃烘干备用。

2．称取50mg尼龙毛均匀分散后置Hanks液中浸泡。取1 ml注射器出口接塑料管并夹住，将尼龙毛均匀填塞入注射器中排净空气，柱高5～6cm此柱可分离约2x107细胞。

2．用5 ml预温至37℃的细胞培养液洗涤尼龙毛柱将0.5 ml上述PMC悬液加入尼龙毛柱中。待细胞悬液全部进入尼龙毛柱后立即加0.2ml细胞培养液，夹住塑料管

3．在37℃,5% CO2培养箱中培养1小时，使细胞與尼龙毛充分黏附用5 ml预温至37℃的细胞培养液洗脱尼龙毛柱，洗脱液中含有纯的T细胞1000r/min离心洗脱液10分钟，去上清液再用细胞培养液洗涤細胞并计数，用细胞培养液将细胞配成适当浓度用力反复挤压尼龙柱，挤出黏附在尼龙柱上的细胞并用少量的RPMI 1640培基洗脱，此细胞悬液含有丰富的细胞

如此得到的T细胞纯度在90％以上，细胞纯度可达80%

1．基本上何时结束收集取决于流出液体中细胞的浓度，实际上收集的量达到一个柱体积时就可以停止收集，因为即使收集更多的量回收率几乎不会增加。

2．尼龙毛采用辐射灭菌

（三）流式细胞仪分离T细胞和细胞

cytometry,FCM）主要原理是细胞经荧光染色后，通过高速流动系统细胞排成单行，逐个流经检测区进行测定当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流使液流断裂成一连串的均匀小滴（40000个／秒），每小滴内最多含一个细胞（其中只有百分之几的液滴中含细胞）细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收转换成脉冲信号，数据经电脑处理分辨细胞的类型。如识别的是预计所需的细胞时（如T细胞、细胞）在细胞样品流断裂成小滴时，使液滴瞬即感应阳电荷、阴电荷或不带电荷使所需的细胞在电场偏转下进入不同嘚收集管。本法分离细胞准确快速能保持细胞活力，并可在无菌条件下进行

1. RPMI 1640培养基应选购不含的，使用时加入5％的

2. FITC-抗CD3单克隆抗体FITC为異硫氰酸荧光素，CD3为T细胞表面特有的蛋白质分子（分化抗原）

1．用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离单个核细胞，用RPMI 1640培养基配成1x107/ml

3．按操作手册规程进行流式细胞仪分析。

用流式细胞仪进行分析在散射光参数图上选取淋巴细胞群，在荧光参数图上选取绿色荧光阳性的細胞进行分选

1．需要严格无菌操作。

2．由于喷嘴孔很小（70～100um)分选前用30～40 um孔径的滤网过滤细胞悬液，以免稀薄凝块堵塞喷嘴

【关键词】乙醇 小牛血清 酚磺酞

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住院部医师医学“三基”考试

一、选择题（每题 2 分）

1、胸腔穿刺抽液引起急性肺水肿是由于

、抽液过多、过快胸内压突然下降

2、下列哪项禁作骨髓穿刺 D

3、一位休克患者心率快测中心静脉压0.49kpa(5cmH2O),应采取A A、迅速补充液体、控制小量输液C、心功能不全立即给强心、利尿剂

D、控制输液量加用强心剂

E、休克与血容量无关

4、气管切开术后出现广泛皮下气肿最简单的处理方法是D

5、环甲摸穿刺术穿刺针保留时间一般不超过C

6、深部脓肿切开排脓的指征是E

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7、气胸作闭式胸腔引流放置引流管的部位是A

E、胸骨旁线第四肋间。

8、下列通气方法的适应症哪项错误 A

A、间歇通气适用于無自主呼吸者

、压力支持通气适用于有自主呼吸但通气不足者

C、呼气末期正压呼吸适用于成年人呼吸窘迫综合征

D、高频通气适用于无自

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