16大豆凝集素对小肠上皮细胞和红细胞凝集能力的研究
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16大豆凝集素对小肠上皮细胞和红细胞凝集能力的研究
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动物营养学报!&#$&&#!!&!!$%&!$'!&#$%&%'()*$+,($#/+,0)1*#1#($-.大豆凝集素对小肠上皮细胞和红细胞凝集能力的研究!王??幸(!??马秋枝(??刘??强(??&南京农业大学动物科技学院!南京!江苏省化工信息中心有限公司!南京!#()(&&*+%!)(&&!%摘??要??本文旨在测定纯化的大豆凝集素对兔和鸡小肠上皮细胞和红细胞的凝集活性&测定大豆凝集素对红细胞采用!,兔红细胞悬液!测定了使兔红细胞+的凝集能力时!&,凝集的蛋白质浓度&测定对兔小肠上皮细胞的凝集能力时!采用荧光标记-观察荧光显微镜下荧光结合细胞比例的方法定量&经./与新鲜小肠上皮细胞结合后!血凝试验结果表明!使兔红细胞+'而-&,凝集的-./蛋白质浓度为!)+&??$)0*??23!./对鸡的红细胞没有凝1结合率为$集作用&-./对兔小肠上皮细胞有结合能力!&,左右&试验结果说明大豆凝集素的血凝活性具种属特异性!用-./与小肠上皮细胞的结合率作为评价其抗营养活性的指标具一定可行性&关键词??小肠上皮细胞%红细胞%凝集-./%非????凝集素能与特异性糖或糖的复合物专一地(糖专一结合是凝集素最基本的特共价的可逆结合!)*性&36A9A:等(发现大豆凝集素&B=CA是大豆中唯一的含量较高的生物活性蛋969!-./#同时参照传统的红细胞凝集法测定结果!比较化量!为建立评价-不同方法之间的差异!./的抗营养活性的客观方法提供有力依据&白!含量约占大豆蛋白的+,??',!是影响大豆营养价值和产品稳定性的主要因素!其生物学功能通过与细胞的结合而直接或间接的发挥作用&-./是大豆及其制品中主要的抗营养因子之一!其抗性表现为与肠道上皮细胞结合!引起上皮组水肿!同时降低了肠道养分的消化和吸织变态反应(!*收机能)&以往的研究中!有人用对人或动物红细!??材料与方法戊二醛法??!)!??固定化红血球的制备??从心脏采取新鲜兔血!注入加有肝素&'和一颗玻璃珠的锥形瓶中!摇动!以脱$&J23#去纤维蛋白!并在%K下静置!??'L!用!层纱布过滤&取脱纤维后的血液!在!&'&&:269!%K离心'(&269!用M.-&&)&!2=73磷酸缓冲液和'洗涤!在E')!#&)(2=73N5I7的混合溶液!O'如此重复%次!用!&&&:269!%PI离心(&269!制成('的悬液!加入等体M.-冲洗沉淀!&,&QQ#积的含%,戊二醛的M!立即混匀!再加入叠氮.-钠!使叠氮钠的最终浓度为&)'&室温下!,&RQ#!随时注意调整O搅拌(&??(#S&!&??!+K#E使之在')其间间隔!S搅拌(次&然后用M!??')0!.-离心洗涤%次!以除去未作用的戊二醛!最终用M.-配成(在%K下保存备用!该悬液可&,的血球悬液!+*保存$??0个月)&胞的凝集能力来评价大豆制品中-./的含量和抗$*性)&但从营养学角度分析!-./抗营养活性的靶器官首先应该是消化道上皮组织&因此!用红细胞凝集能力来评价其抗营养活性可能存在方法上的缺陷!而且!-./各异构体之间的凝血能力也存在差)*异&E但5=B等%虽然测定了肠道结合-./的量!@是与红细胞的凝集现象不同!-./与上皮细胞的结合状况不易观察和定量评价!因此探讨-./与肠道上皮细胞结合的定量关系有望确立客观评价-./抗营养活性的可行方法&用荧光标记的凝集素作探针检测细胞表面的糖复合物!已成为用于分离细胞和分析糖复合物等常+*用的方法之一)&故而本试验拟用荧光素标记凝集的红细胞凝集能力的测定!)&??大豆凝集素??-./??()!)(??-./对兔红细胞凝集活力的测定在+型血凝板的第(??#列的第(行的孔中Q,分别加入!'+??3缓冲液&&)&'+2=73磷酸缓冲液素通过测定-./&FGHI与小肠上皮细胞结合的变收稿日期??!&&'&&'&!0基金项目??国家自然科学基金资助项目&#$&$&&!+!作者简介??王幸&#!女!浙江诸暨人!硕士!主要从事饲料资源开发利用的研究&4$(*'*&&:!0;&=2??(11刘强!副教授!$4&7=9769A)&=2??通讯作者?????1@??!期王??幸等$大豆凝集素对小肠上皮细胞和红细胞凝集能力的研究??????'&取凝集素溶液T&)&'+2=73氯化钠!E')!#O加入第(孔!与缓冲液混匀后取出!加!+??3!+??3!入第!孔!混匀后再取出!加入第$孔&以此+??3!作倍比稀释直至加到第(类推!!行的孔止&待全部开启振荡器!振荡混匀!同时每孔加入完毕后!血球加毕后继续!+??3固定化好了的!,血球悬液!振荡(静+269左右&血凝板在室温下&!&??!+PI#置()肉眼观察凝集结果&+??!S!察!单个细胞约占*+,即可&经!&&目网筛过滤后!将滤液转入('&23玻璃离心管中!(&&&:269离心+2弃去上清液!用含血清培养液使细胞沉69!细胞计数调整密度后接种于灭过菌的淀重新悬浮!得细胞悬液&培养板中!()$)!??荧光标记大豆凝集素取()&2./与(&&??W7&=&1-1异硫氰酸荧光素&!F:AB&A696B=DS6=&595DAGHI#溶解于&)!23O?如血球不发生凝集时!血球沉于+Q,型孔底部!呈一个红色小圆点%如完全凝集时血球相互集聚形成均匀网络!血球不下沉&根据血球的凝集程度!划分为以下%个等级$??不凝集$血球全部沉积于+Q,型孔底部!呈边缘清晰的红褐色小圆点%??少许凝集$大多数血球沉积于+Q,型孔底部!红色圆点边缘模糊%??半凝集$血球部分沉积+Q,型孔底部!周围有一混浊带!约占孔面积的+&,%??大部分凝集$血球少许沉积于孔中心!周围的混浊带面积大于孔面积的+&,%??全凝集$血球相互集聚形成均匀网络状!血球不下沉&凝集活力判定以+&,凝集为终点)0*&试验中设计了一个-./的浓度梯度!起始浓度分别为()&(&)#(&)+(&)!(&)((&)&+和)&!21'23!同一列的-./浓度是倍比减小的&最后是一个只加缓冲液和红细胞的空白对照!结果见表(&表中数字+(,代表少许凝集!+!,代表半凝集!+$,代表大部分凝集!+%,代表全凝集!+&,代表不凝集&其中平均值在$)0'??%)&&即可判定为全凝集!!)0'??$)$$判定为大部分凝集!()0'??!)$$判定为半凝集!&)0'??()$$判定为少数凝集!&)0'以下即为不凝集&)!)!??-./对新鲜红细胞凝集活力的测定采用鸡(兔红细胞新鲜血液!配制成!,悬液按上述方法进行凝集活性测定&)#??-./对小肠上皮细胞结合能力的测定)$)(??兔小肠上皮细胞悬液的制备将兔放血处死后!取小肠&十二指肠与空肠#放入U&E59V-B溶液中!纵向剪开小肠!用U&E59V-B反复冲洗!洗去食糜!直到U&E59V-B溶液不再浑浊为止!然后用载玻片轻轻刮取小肠表层组织!刮取物放入盛有U&E59V-B的烧杯中&取上述组织悬液&23!加+23&)(+,的胰蛋白酶消化液!$'K消化+269!用含血清的培养液终止胰蛋白酶的活性!用吸管轻轻吹打分散细胞团块!在倒置显微镜下观&;(+2=7'3磷酸氢二钠溶液&OE*)&#!在!+K恒温振荡水浴锅中保温培养!&S&然后在含()&22=7'3I5I7!(()&22=7'3X1I7!((;&22=7'3X9I7!和&)+2=7'3N5I7的&)&+2=7'3H:6B&EI7缓冲液&OE';&#中充分透析!更换透析液$??+次!除去未反应的荧光素&以透析液颜色不发生明显变化判定为透析完全&将标记好的大豆凝集素储存于棕色试剂瓶!%K保存备用)'*&()$)$??-./&FGHI与小肠上皮细胞的结合测定在兔新鲜小肠上皮细胞悬液中加入足量的-./&FGHI溶液!在$'K恒温水浴中摇浴$&269!使细胞与-./&FGHI充分结合&取出后加入等量体积的&)(2=7'3M.-&OE#)&#溶液!轻轻摇匀后!%K!(&&&:'269!冷冻离心(&269!取沉淀!再加入等量的M.-溶液!重复离心$次!以除去未结合的-./&FGHI&取沉淀用M.-溶解摇匀!在荧光显微镜下观察)+*!计数得有荧光的肠细胞占同一视野下细胞总数的百分数&&??结果与分析&)!??-./对红细胞凝集能力的测定不同浓度-./对兔红细胞悬液的凝集程度见表(&由表(可以计算出使+,兔红细胞凝集的-./浓度为!;+&??$;0*??1'23&&)&??-./对新鲜红细胞的凝集能力的测定用上述方法评价-./对鸡红细胞的凝集能力!结果表明!无论是新鲜红细胞还是用胰蛋白酶处理后的红细胞!-./均不凝集鸡红细胞悬液!而对兔新鲜红细胞悬液则有明显的凝集能力&&)#??-./对小肠上皮细胞的结合能力测定-./&FGHI与兔小肠上皮细胞结合后!在荧光显微镜下可以清楚的看到荧光!如图(所示&有荧光的肠细胞占同一视野下细胞总数的百分数即为-./的肠细胞结合率&计数得兔的-./肠结合率为&$()%Y&)##,&&(!(!??????动??物??营??养??学??报表!??不同浓度-./对兔红细胞悬液的凝集程度评分H5C7A(??HSA57&D695D6=9B&=:A=W:5CC6D:ALC7==L&A77B&BA9B6=9&9LA:&=9&A9D:5D6=91:5L6A9D=W-./11O!&卷??稀释倍数U67&D6=9D62AB&!(!!!$!%!+!0!'-./起始浓度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本试验还发现-./的浓度大小对其细胞凝集活性有很大影响&-凝集的活性越./浓度越大!大!这是因为凝集素的凝集活力&凝集效价#与凝集素的量成线性关系&并且经计算知使+&,兔红'这细胞凝集时的-./浓度为!)+&??$)0*??23!10*一结果与孙册等)的记载结果基本一致&#)&??-./的小肠上皮细胞结合能力在用-./&FGHI复合物结合肠细胞悬液的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　植物凝集素具有细胞凝集、 抗病毒、 抗真菌及诱导细胞凋亡或自噬等多种能力, 因此在生命科学、 医学及农业方面均有较好的研究价值和应用前景。 本文综述了植物凝集... 　使红细胞凝集作用, 因此开始被称为植物血凝集素 (...凝集恶性细胞、精子、 骨髓细胞等 的能力[5 ] . ...如利马豆凝集素(PLA) 、大豆凝集素(SBA) 、蓖麻... 　 掌握凝集素促使细胞凝集的原理; 学习研究细胞凝集...凝集素 A、麦胚凝集素、花生凝集素和大豆凝集素等...凝集素的细胞悬液 发生了细胞凝集现象,红细胞凝集在... 　 细胞凝集反应一、实验目的 1.了解细胞膜的表面结构 2.掌握凝集素促进细胞凝集的方法 3.学习研究细胞凝集反应的方法 二、实验原理凝集素是一类可逆结合特异糖基的... 　 细胞凝集指的是细胞与细胞之间通过某种凝集素的作用...大量研究发现,凝集素可作为 肿瘤特异性诊断的标志和...的结果有很 大的帮助,对每个人的能力提高也发挥着... 　Renkonnen 发现它们对血细胞凝集时具有 选择性。随着对红细胞凝集反应中血型特异...大豆和菜豆中的凝集 素多与小肠前段上皮细胞的多糖受体结合,而豌豆 中的凝集素... 　学习研究细胞凝集反应的方法。 【实验原理】 1.凝集素 凝集素是一类含糖 (少数例外) 并能与糖转移结合的蛋白质, 它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。 目前已... 　是从植物中萃取的一种糖蛋白和蛋白质的混合物,因可引起红细胞凝集而得名_临床...文章亮点: 1 植物凝集素是常用的分裂原,但是植物凝集素对细胞凋亡作用的研究... 　细胞凝集反应实验报告【摘要】细胞凝集素可以将不同的细胞粘连在一起, 在显微镜下可以观 察到最终形成大的细胞团块,可以观察到细胞的凝集现象。通过不同 的变量,...改良凝聚胺试剂盒(150人份) - 上海血液生物医药有限责任公司
改良凝聚胺试剂盒(150人份)[名称]
通用名称：改良凝聚胺试剂盒
英文名称：Modified Polybrene Kit
[包装规格]& 450人份；150人份
450人份&&&&&&&&&&&&& 150人份
凝聚胺溶液(Polybrene)&&&&& 3×10ml&&&&&&&&&&&&&& 10ml
重悬液&&&&&&&&&&&&&&&&&& 3×10ml&&&&&&&&&&&&&&& 10ml
阳性对照液&&& &&&&&&&&&&&&&3ml&&&&&&&&&&&&&&&&& &1ml
阴性对照液 &&&&&&&&&&&&&&&&3ml&&&&&&&&&&&&&&&&& &1ml
低离子强度溶液(LIM溶液)&& 3×100ml&&&&&&&&&&&&& 100ml
[预期用途] 快速定性检测红细胞免疫抗体。适用于交叉配血试验,红细胞抗原抗体检测试验。
[检验原理] 凝聚胺（Polybrene）是一种高价阳离子季胺盐多聚物，溶解后产生较多正电荷，可以中和红细胞膜表面的唾液酸带有的负电荷，使红细胞之间的距离减少。若是未被抗体致敏的红细胞，则产生可逆的非特异性的凝集，加入重悬液后散开，为阴性反应；若是抗体致敏的红细胞，则凝集不可逆，加入重悬液后不会散开,为阳性反应。
本试剂盒主要特点是利用独创的低离子强度（LIM）溶液直接配制红细胞，从而实现快速检测红细胞免疫抗体。
[主要组成成份] 每个试剂盒由凝聚胺溶液（Polybrene）、重悬液、低离子强度溶液（LIM）、阳性对照液、阴性对照液组成。主要成份如下:
凝聚胺溶液(Polybrene):0.05%凝聚胺、2%小牛血清、4.5%葡萄糖、2.5%磷酸二氢钠；
重悬液:12%枸橼酸钠；
阳性对照液:0.1%抗D（IgG）；
阴性对照液:AB血浆；
低离子强度溶液(LIM):50%葡萄糖、0.7%乙二胺四乙酸二钠、抗生素等。
[储存条件及有效期] 2-25℃(其中阳性和阴性对照应储存在2-8℃)；
&&&&&&&&&&&&&&&&& 在储存条件下有效期24个月。
[样本要求]按照常规的血液样本采集步骤，采集患者或供血者、受血者的血液，收集血清或血浆作为检测样品。
[检验方法]
1. 基本操作方法（LIM溶液直接配制红细胞）：
1.1 取一支试管，加入待检血清或血浆1滴(50ul)。
1.2 加入用LIM溶液配制的3%左右红细胞悬液2滴(100ul)。
1.3 摇匀，室温放置至少1分钟（时间长效果好）。
1.4 加凝聚胺溶液1滴(50ul)，混匀后以3400转/分（1000g）离心1分钟。
1.5 轻摇观察由凝聚胺引起的红细胞非特异性凝集，若未见红细胞凝集则需重做。
1.6 加入1滴(50ul)重悬液轻摇看结果。由凝聚胺引起的非特异性凝集应在1分钟内完全散开，若是由免疫抗体引起的凝集反应则不会完全散开。
2. 配血试验
2.1 取2支试管，标明主、次侧。
2.2 主侧管加入患者血清（或血浆）1滴(50ul)，再加入用LIM溶液配制的3%左右献血者红细胞悬液2滴(100ul)，混匀。
2.3 次侧管加入献血者血清（或血浆）1滴(50ul)，再加入用LIM溶液配制的3%左右患者红细胞悬液2滴(100ul)，混匀。
2.4 以3400转/分(1000g)离心15秒，看结果并记录。
2.5 若结果为阴性，则加凝聚胺溶液1滴(50ul)，摇匀。
2.6 以3400转/分(1000g)离心1分钟，轻摇观察由凝聚胺引起的红细胞非特异性凝集，若未见红细胞凝集则需重做。
2.7 加入1滴(50ul)重悬液轻摇看结果。由凝聚胺引起的红细胞非特异性凝集应在1分钟内完全散开，若是由免疫抗体引起的凝集反应则不会完全散开。
3．经典操作方法（已配制3%左右细胞）:
3.1 试管中加2滴(100ul)待检血清，加1滴(50ul)试剂红细胞。
3.2 加LIM溶液12滴（0.6毫升）混匀，室温放置1分钟。
3.3 加入2滴(100ul)凝聚胺溶液混匀，以3400转/分(1000g)离心1分钟。
3.4 倒去上清液观察红细胞凝集，若未见凝集则需重做。
3.5 加入1滴(50ul)重悬液轻摇看结果。由凝聚胺引起的红细胞非特异性凝集应在1分钟内完全散开，若是由免疫抗体引起的凝集反应则不会完全散开。
[检验结果的解释]
阴性结果：红细胞迅速散开，并在1分钟内完全散开。
阳性结果：红细胞不完全散开,弱凝集可能在30分钟内明显减弱或消失，因此以立刻看结果为准。
质控试验：可以用阳性对照试剂代替待检血清按同样步骤进行质控试验，结果应为”1+”的弱凝集。
[检验方法的局限性] 凝聚胺方法对检测Kell系统的抗体不理想，对Kell系统抗体检测有要求的地区，阴性结果需进行抗球蛋白试验。
[产品性能指标]
1．外观：凝聚胺溶液、重悬液、阳性对照液为无色澄清液体，阴性对照液为黄色的澄清液体，低离子强度溶液为无色或黄色的澄清液体。
2．特异性试验：阳性对照试验，结果为(＋)以上；阴性对照试验，结果为(－)。
3．低离子强度溶液的电导率值：为0.4×103～1.0×103us/cm。
4. 低离子强度溶液的pH值：为8.5～9.5。
5．& 阳性对照液：试验结果为(＋)。
6．阴性对照液：试验结果为(－)；生物安全性试验为阴性。
7．试剂盒灵敏度试验：分别用强抗体[抗D(IgG)]，中等强度抗体(抗Jka)和弱抗体(抗Fya)检测，均为(＋)以上。
[注意事项]
1.&&&&&& 配制LIM红细胞悬液：取抗凝或不抗凝的血样标本的浓缩红细胞可直接加LIM溶液配制悬液，若红细胞中含有较多血清或血浆，则需要用LIM溶液洗涤细胞一次，红细胞悬液浓度为3％左右，该悬液可替代盐水红细胞使用。
2.&&&&&& 加入血清量应严格按照操作方法，多加血清会提高离子强度，降低致敏效果。
3.&&&&&& 凝聚胺是一种抗肝素药物，所以使用含肝素之标本，需多加2滴(100ul)凝聚胺溶液，以中和肝素。
4.&&&&&& 冷凝集处理：在室温较低时（&15℃），冷凝集会因使用凝聚胺方法而加强，建议使用LIM溶液配置的红细胞悬液加待检血清直接离心进行盐水对照试验。如果在盐水法试验中发现有冷凝集，则可将凝聚胺试验结果置37℃1分钟后再判读，这时较弱的冷凝集会散开，真凝集会有所减弱，但不会完全散开。或者在室温致敏1分钟后用温盐水（45℃）三洗，进行间接抗球蛋白试验。
5.&&&&&& 本品仅用于体外诊断。
[生产企业]
企业名称－上海血液生物医药有限责任公司
注册地址－上海市黄浦区南京西路479弄10号
生产地址－上海市长宁区虹桥路1191号
邮政编码－200051
电话－021-754841
传真－021-
[医疗器械生产企业许可证编号]沪食药监械生产许号
[医疗器械注册证书编号] 国食药监械（准）字1号
[产品标准编号] YZB/国
[说明书批准及修改日期]日母体效价SOP_百度文库
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红细胞悬液使用白细胞过滤器的实验报告
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