荷瘤小鼠实验方法
荷瘤小鼠实验方法
09-12-22 &匿名提问 发布
[1]南方医科大学附属南方医院,广东广州]南方医科大学中医药学院,广东广州510515文章摘要:目的:研究鳖甲煎丸对荷瘤小鼠抑瘤作用及其对胸腺指数、脾指数的影响.方法:分设鳖甲煎丸高、低剂量组,分别对H22荷瘤小鼠连续15d灌胃给药后,测其抑瘤率及胸腺指数、脾指数,并与环磷酰胺组比较.结果:鳖甲煎丸高剂量组抑瘤率达到31.8%,治疗后瘤重明显低于阴性对照组,体重、胸腺指数、脾指数情况明显优于环磷酰胺组.结论:鳖甲煎丸不仅可抑制肿瘤生长,还对胸腺、脾脏有保护作用,在抗肿瘤方面具有广阔的前景.文章内容:实验研究鳖甲煎丸对荷瘤小鼠抑瘤作用及其对胸腺,脾指数影响的实验研究张绪慧1陈达理2罗荣城(1.南方医科大学附属南方医院,广东广州.南方医科大学中医药学院,广东广州510515)提要目的:研究鳖甲煎丸对荷瘤小鼠抑瘤作用及其对胸腺指数,脾指数的影响.方法:分设鳖甲煎丸高,低剂量组.分别对,,荷瘤小鼠连续15灌胃给药后.测其抑瘤率及胸腺指数,脾指数,并与环磷酰胺组比较.结果:鳖甲煎丸高剂量组抑瘤率达到31.8%.治疗后瘤重明显低于阴性对照组,体重,胸腺指数,脾指数情况明显优于环磷酰胺组.结论:鳖甲煎丸不仅可抑制肿瘤生长.还对胸腺,脾脏有保护作用,在抗肿瘤方面具有广阔的前景.关键词鳖甲煎丸,,荷瘤小鼠抑瘤率胸腺指数脾指数中图分类号2895文献标识码文章编号06)09—0072—02经方鳖甲煎丸为医圣张仲景所创.原用于治疗&瘾瘕&,&疟母&由于该方具有寒热并用,攻补兼施,行气化瘀,软坚散结之功.目前广泛应用于肝癌,胃癌及卵巢囊肿等疾病但由于该方用药味数多.许多药物临床罕用.且制剂独特.所以对该方的研究仅限于临床病案报道.缺乏现代科学依据.势必妨碍其进一步推广运用笔者通过对该方的实验研究.旨在阐明鳖甲煎丸的抗肿瘤作用,探讨其抗肿瘤机制.为其临床应用提供现代科学依据1材料与方法1.1药物鳖甲煎丸.杭州胡庆余堂有限公司生产,批号020602环磷酰胺.江苏恒瑞医药股份有限公司生产.批号.2动物及瘤株昆明种小鼠.购于广卅中医药大学动物中心,雄性,18~22.,,小鼠肝癌,购于中山医科大学肿瘤研究所1_3实验方法1_3.1鳖甲煎丸药液的制备用蒸馏水将鳖甲煎丸分别配成每毫升含0.048,0.024生药的高,低两个剂量的悬浊液,4冰箱保存.用时摇匀.1_3_2造模选择接种瘤细胞后的小鼠颈椎脱臼处死.固定于蜡板上.无菌抽取乳白色腹水液.以0.9%氯化钠溶液1:1稀释.经0.2%台盼兰染色后计算活细胞数大于95%.调整瘤细胞悬液浓度为61.每只小鼠右后肢皮下接种0.21.24后用药1.3-3分组及给药将荷瘤小鼠随机分为4组.每组1只.即鳖甲煎丸高剂量组,鳖甲煎丸低剂量组,阴性对照组和环磷酰胺组.鳖甲煎丸高,低剂量组分别按12/(?),6/(?)灌胃,阴性对照组予相同容量的蒸馏水灌胃.环磷酰胺组按20/(.)腹腔注射.连续用药15后停药处死.称取瘤重1_3.4取材处死小鼠后剥离瘤块用滤纸吸干后称重取出小鼠脾脏和胸腺.用滤纸吸干后称重1.4评定指标1)肿瘤抑制百分率(抑瘤率):抑瘤率(%)=(阴性对照组平均瘤重一治疗组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重0%(2)比较各组小鼠实验前后体重的变化情况:(3)胸腺指数,脾指数测量方法同文献1.5统计学方法用1.0统计软件做单向方差分析2实验结果2.1鳖甲煎丸对,,移植性肿瘤的抑制作用治疗后瘤重.鳖甲煎丸高,低剂量组均小于阴性对照组.有显着性差异(190.1);鳖甲煎丸高,低剂量组间亦有显着性差异(.05);鳖甲煎丸高剂量组与环磷酰胺组比较无显着性差异(0.05).见表1.2.2荷瘤小鼠在实验前后的体重变化用药前各组小鼠体重无显着性差异(0.05).用药后与环磷酰胺组比较.阴性对照组,鳖甲煎丸高剂量组,鳖甲煎丸低剂量组的小鼠体重均有显着增加(.1);阴性对照组,鳖甲煎丸高剂量组与鳖甲煎丸低剂量组比较.亦有显着性差异(0.01):鳖甲煎丸高剂量组与阴性对照组比较无显着性差表鳖甲煎丸对移植性肿瘤的抑制作用(互)注:与阴性对照组比较,.01;与鳖甲煎丸低剂量组比较,0.05,0.01.基金项目:2002广东省中医药局基金资助课题(102077)田!!竺兰!堂竺!塑中医为表2各组荷瘤小鼠实验前后体重变化(互)注:与环磷酰胺组比较,0.05,0.1;与鳖甲煎丸低剂量组比较,..表3各组荷瘤小鼠治疗后胸腺指数和脾指数情况(互)与环磷酰胺组比较,0.05,0.;与鳖甲煎丸低剂量组比较..05.异(.05).见表2.2_3鳖甲煎丸对荷瘤小鼠胸腺指数和脾指数的影响与环磷酰胺组相比.鳖甲煎丸高,低剂量组均能显着提高荷瘤小鼠胸腺指数和脾指数:鳖甲煎丸高低剂量组与阴性对照组的胸腺指数睥指数相比无显着性差异(.05):鳖甲煎丸高剂量组的胸腺指数明显高于鳖甲煎丸低剂量组(.05)见表3.常州3讨论鳖甲煎丸是经典的抗肿瘤方.广泛应用于临床.本实验通过用环磷酰胺作为阳性对照药.来阐明鳖甲煎丸的抗肿瘤效果.环磷酰胺是临床常用的化疗药.能有效地杀伤癌细胞(本实验其抑瘤率达到34-3%).但与此同时也对人体产生不同程度的毒副作用.主要表现为骨髓抑制,免疫功能低下和白细胞减实验研究少.药效方面.鳖甲煎丸高剂量组抑瘤率达到31.8%.鳖甲煎丸低剂量组亦达到20.8%;治疗后鳖甲煎丸高剂量组平均瘤重与环磷酰胺组无显着性差异.而与低剂量组存在显着性差异(.05)这说明鳖甲煎丸在抗肿瘤方面疗效显着.且存在着量效关系本实验还通过实验前后各组小鼠体重变化以及胸腺指数,脾指数的比较.说明了环磷酰胺的毒副作用.同时提示鳖甲煎丸对小鼠免疫器官无损害作用.显示了鳖甲煎丸抗肿瘤的优越性.体现了中医药理论上的整体观念总之鳖甲煎丸既能有效抑制肿瘤的生长又能提高免疫功能从而达到攻邪扶正之效.有广阔的抗肿瘤前景.4参考文献【11陈奇,中药药理研究方法学.北京:人民卫生出版社.】万军梅,吴巍,曹华等.升白丸对环磷酰胺致小鼠白细胞减少症的影响.时珍国医国药,):513作者简介:张绪慧(1977一),男,在读博士研究生.肿瘤学专业.研究方向为肿瘤的靶向诊断与靶向治疗收稿日期:编辑:吴宁市中医院举行弘扬传承孟河医学青年专家拜师仪式日,常州市中医院隆重召开了以&挖掘,传承,鼎新,发展&为主题的继承创新大会暨孟河医学研究所成立大会,同时举行了庄严而隆重的拜师仪式.周仲瑛,朱良春,石印玉,丁
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[摘要]目的
探讨高压氧(HBO)对小鼠CT26结肠癌细胞周期和荷瘤小鼠肿瘤生长的影响。 方法
应用流式细胞仪检测对照组和HBO组CT26癌细胞的细胞周期;建立小鼠结肠癌移植瘤模型，观察0.2MPa HBO对CT26癌细胞移植瘤生长的影响。 结果
对照组细胞在G0 .G1 期、S期、G2 .M期的比例分别为74.82%、20.38%、4.80%;而HBO后12h组为66.48%、33.16%、0.36%，HBO后24h组为55.89%、40.79%、3.32%。HBO组小鼠肿瘤的体积和重量较模型对照组降低，肿瘤体积抑制率为32.39%，重量抑制率为35.77%。 结论
HBO可使CT26细胞在S期积蓄，并抑制荷瘤小鼠移植瘤的生长。
&&&&[关键词] 高压氧;细胞周期;CT26癌细胞;移植瘤;肿瘤抑制率
&&&&Effects of hyperbaric oxygen on the cell cycle and proliferation of CT26
&&&&in vitro or in vivo
&&&&WANG Ai-guo，ZHANG Li-da，ZHANG Wei，HUANG Ping，RUI Zong-dao，CHEN Guo-min，HUANG Pei-lin
&&&&(1.Department of Pathology，School of Basic Medical Science，Southeast University，Nanjing210009，C2.Department of Hyperbaric Oxygen，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing210009，C3.Department of General Surgery，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing210009，China)
&&&&Abstract:Objective To study the effects of hyperbaric oxygen(HBO)on the cell cycle and proliferation of CT26in vitro and in vivo.Methods The cell cycle of CT26under HBO and normobaric carbogen were examined with flow cytometry.Established BALB.c mouse tumor models，the volumes and weight of tumors under0.2MPa HBO were observed.Results The percentages of cells in G
&&&&0 .G1 、S、G2 .M of control group were74.82%，20.38%and4.80%HBO12h group were66.48%，33.16%and0.36%HBO24h group were55.89%，40.79%and3.33%respectively.Calculated by weight or volume，the transplanted tumor growth was inhibited32.39%in weight，35.77%in volume.Conclusion HBO may induce CT26cells accumu-lating in S phase in vitro，and inhibit the growth of tumors in vivo.
&&&&Key words:CT26tumor inhibitory ratio
&&&&高压氧(hyperbaric oxygen，HBO)作为一种辅助治疗手段已广泛应用于临床，但对HBO能否用于肿瘤的辅助治疗尚有争议。有学者认为，HBO可以减轻癌症患者术后、放疗和化疗后遗症;HBO联合化疗药物可以增强肿瘤对化疗药物的敏感性。另有人认为，HBO本身可能会刺激肿瘤组织的增生。为此，作者通过细胞培养和动物实验，初步研究了HBO对CT26结肠腺癌细胞周期及荷瘤鼠肿瘤生长的影响。
1 材料和方法
&&&&1.1 CT26结肠腺癌细胞株
&&&&小鼠结肠癌细胞(CT26)株由上海第二军医大学免疫教研室惠赠。细胞培养于含10%小牛血清的RP-MI1640培养液(pH7.2)(美国GIBCO公司)中，在37℃、体积分数为0.05的CO2 、充分湿度条件下培养，细胞呈单层贴壁生长，每2～3d传代1次。
&&&&1.2 BALB.c小鼠移植瘤模型的建立
&&&&待CT26癌细胞贴壁生长后，取对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化，离心后用生理盐水吹打成细胞悬液，在无菌实验条件下，将癌细胞悬液按每只0.2ml(2.0×106 个细胞)接种于BALB.c小鼠右腋皮下，注射局部出现明显皮丘，3～4d后出现结节，10d后结节直径约1cm，手术剥离瘤体，切成小块接种在另外3只小鼠右腋皮下，如此在小鼠体内反复传代两次后，最后再剥离瘤体，将瘤组织块切成1mm3 大小，用外科手术套管针接种到小鼠右腋皮下，7d后挑选其肿瘤直径约0.5cm左右的小鼠分组实验，至此，移植瘤模型建立。
&&&&1.3 实验动物及分组
&&&&BALB.c小鼠购自中科院上海斯莱克实验动物中心，4～6周龄，体重(22±2.0)g，雌雄各半，饲养于清洁级动物室，室温为22～25℃。垫料、饮用水和食物均经消毒灭菌，随机取8只无瘤鼠作空白对照组。从荷瘤模型鼠中挑选16只(荷瘤直径约0.5cm)随机分为模型对照组(8只，常压常氧下饲养)和HBO实验组(8只)。HBO实验组每日进入动物加压舱吸氧(0.2MPa)1次，每次持续90min，其中前15min缓慢升压，当舱压升至0.2MPa稳压，持续1h后缓慢减压，在15min内减压至常压状态后出舱。共暴露于高压氧15次。
&&&&1.4 细胞周期检测
&&&&将呈对数生长期CT26细胞分为3组:(1)正常对照组:即不作HBO暴露;(2)HBO12h组:无菌状态下细胞暴露于0.2MPa HBO(控制氧压方法见1.3)，出舱后继续培养12h;(3)HBO24h组:无菌状态下细胞暴露于0.2MPa HBO(控制氧压方法见1.3)，出舱后继续培养24h。用0.25%胰酶消化上述3组细胞，同时收集细胞1×106 个，800～1000r?min-1 离心5min，弃去 培养液，PBS洗3次，离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定(4℃，1h)，用FACS Calibur流式细胞仪(Bectionj-Dickinson公司)检测细胞周期。
&&&&1.5 肿瘤抑制率计算
&&&&按实验设计要求，移植瘤模型建立后次日隔天用游标卡尺测量皮下肿瘤的长径(a)和短径(b)，用公式V=1.2ab2 ，计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。实验进行15d后处死动物，剥离皮下肿瘤，测量其大小并用电子秤(上海天平仪器厂)称重，用公式肿瘤抑制率=(对照组-实验组)/对照组×100%，计算肿瘤抑制率。
&&&&1.6 统计学处理
&&&&数据的处理采用t检验，P<0.05有统计学意义。
&&&&2.1 移植瘤模型的病理学观察
&&&&处死动物后，所有移植肿瘤的动物均见肿瘤生长，其移植成功率为100%。肉眼可见肿瘤呈结节状，包膜较完整，未向周围浸润，肿瘤切面呈灰白色，无出血坏死灶;镜下观察:移植瘤为低分化结肠腺癌(图1)。
&&&&图1 CT26低分化结肠腺癌(HE染色，高倍放大)
&&&&2.2 HBO对CT26细胞周期的影响
&&&&流式细胞仪检测细胞G0 .G1 期、S期、G2 .M期比例结果显示:对照组为74.82%、20.38%、4.80%;HBO12h组为66.48%、33.16%、0.36%;HBO24h组为55.89%、40.79%、3.32%。提示HBO可诱导CT26细胞在S期积蓄，且HBO处理24h后S期积蓄量要略高于HBO处理12h(图2)。
&&&&2.3 HBO对BALB.c小鼠肿瘤生长的影响
&&&&通过动态观测各组肿瘤大小，绘制肿瘤体积变化图，可见HBO组肿瘤的体积增长较对照组缓慢(图3)。
&&&&2.4 HBO对CT26移植瘤生长的影响
&&&&HBO15d后，与模型对照组比较HBO组肿瘤体积和重量均低，差异有显著意义(P<0.01)(表1)。HBO组肿瘤体积抑制率为32.39%;肿瘤重量抑制率为35.77%。表1 HBO对CT26移植瘤生长的影响(略)
&&&&目前，恶性肿瘤的治疗方法主要是手术、化疗和放疗，但都会引起并发症，同时，在肿瘤组织中大约有三分之一的癌细胞处于乏氧状态，这是癌细胞对放疗和化疗产生耐受的主要原因之一[1] 。HBO是机体呼吸压力超过0.1MPa的纯氧而用于治疗疾病的一种新手段，它能改善微循环，提高氧分压，增强机体免疫机能，临床上已将其应用于多种疾病的治疗和辅助治疗，但是对于HBO用于肿瘤治疗尚有争议。1966年Johnson和Lauchlan首次报道HBO可能促进肿瘤增长[2] ;而近年来相继有人报道[3] HBO是肿瘤患者较好的辅助疗法;Linda等[4] 发现，单纯HBO对DMBA诱导的鼠乳腺癌抑制率为17%～24.2%。
&&&&本实验通过细胞培养结果显示，HBO能使CT26癌细胞重新进入循环，并在S期积蓄，提示我们能否用HBO联合细胞周期特异性药物对癌症患者进行治疗，以增强细胞周期特异性药物的敏感性。这样不仅能减轻肿瘤患者化疗后遗症，还能降低化疗药物的用药剂量。我们的动物实验结果提示，HBO本身并未刺激肿瘤生长，相反，HBO对荷瘤鼠移植瘤的生长有一定的抑制作用，这进一步支持了HBO联合细胞周期特异性药物治疗肿瘤的可行性。
&&&&目前，有关HBO对肿瘤的作用机制仍不明确。有人认为HBO提高了肿瘤组织的氧自由基含量，而氧自由基对肿瘤的生长具有抑制作用[5] ;另有人认为大量乏氧细胞的存在是肿瘤产生耐药性的主要原因[1] 。为了能够逃避缺氧所造成的细胞损伤或死亡，一些乏氧的肿瘤细胞可通过改变基因表达来适应缺氧环境。目前研究的热点基因是缺氧诱导因子1α(hypoxia induc-ible factor1alpha，HIF.1α)，肿瘤组织通过提高HIF.1α的表达调控癌细胞的缺氧性凋亡、细胞生长抑制及肿瘤血管化，其过程中HIF.1α可能调控血管内皮生长因子、促红细胞生成素、糖酵解酶等的表达，从而适应缺氧环境而继续增殖[6，7] ，而有研究报道，HIF.1α在常氧压下会降解，随着氧含量增加，肿瘤组织中HIF.1α越来越低，使肿瘤的生长受到抑制[7，8] 。我们给实验动物高压氧处理，从而提高了肿瘤组织的氧供，可能使肿瘤细胞内的自由基含量增加、HIF.1α的表达下调等，进而导制肿瘤的生长受到抑制。
&&&&[参考文献]
&&&&[1]HAFFTY B G，HURLEY R A，PETERS L G.Carcinoma of the larynx treated with hypofractionated radiation and hyperbaric oxy-gen:long-term tumor control and complications[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys，.20.
&&&&[2]JOHNSON R J R，LAUCHLAN S C.Epidermoid carcinoma of the cervix treated by60℃therapy and hyperbaric oxygen[Z].Pro-ceedings of the Third Congress on Hyperbaric Medicine，. 652.
&&&&[3]FELDMEIER J，CARL U，HARTMANN K，et al.Hyperbaric oxy-gen:does it promote growth or recurrence of malignancy?[J].Un-dersea Hyperb Med，.18.
&&&&[4]STUHRA L E B，IVERSEN V V，STRAUME O，et al.Hyperbaric oxygen alone or combined with5.FU attenuates growth of DMBA-induced rat mammary tumors[J].Cancer Lett，.40.
&&&&[5]练庆林，杭荣椿，严惠芳，等.高压氧对小鼠s-18肉瘤化学治疗增效作用研究[J].中华航海医学杂志，.33.
&&&&[6]FELDKAMP M M，LAU N，RAK J，et al.Normoxic and hypoxic regulation of vascular endothelial growth factor(VEGF)by astrocy-toma cell is mediated by Ras[J].Int J Cancer，.120.
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&&&&[8]D′ERY，MARC.ANDR′E C，MICHAUD MD，RICHARD D E.Hy-poxia-inducible factor1:regulation by hypoxic and non-hypoxic ac-tivators[J].Int J Biochem Cell Biology，.540.
&&&&1.东南大学基础医学院病理学系，江苏南京 210009;
&&&&2.东南大学附属中大医院高压氧科，江苏南京 .东南大学附属中大医院普外科，江苏南京 210009
&&&&[基金项目] 江苏省教育厅科研基金资助项目(HJ03-059);南京市社会发展科技项目()。
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