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荧光定量RT－PCR检测mdr－1基因表达
癌症 2000年第3期第19卷 快速报道
作者：高劲松　马刚　仝明　陈佩毅　王传华　何蕴韶
单位：高劲松（中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089）；马刚（中山医科大学肿瘤防治中心胸外科,广东广州510060）；仝明（中山医科大学肿瘤防治中心胸外科,广东广州510060）；陈佩毅（中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089）；王传华（中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089）；何蕴韶（中山医科大学达安基因诊断中心,广东广州510089）
关键词：荧光定量检测；RT－PCR；mdr－1基因；基因表达
　　摘　要：目的：建立荧光定量RT－PCR检测肿瘤细胞mdr－1基因表达的方法，了解肺癌组织中mdr－1的表达水平。方法：建立荧光定量RT?PCR方法，在PE7700型检测仪上定量检测K562/ADM耐药株和K562不耐药株细胞mdr?1基因表达水平，同时检测45例初治肺部肿瘤病人组织标本。结果：荧光定量RT－PCR检测K562/ADM耐药株和K562不耐药株细胞mdr－1基因表达，重复10次实验所得结果平均分别为(6.86±0.65)×107拷贝/μgRNA和(8.49±0.67)×105拷贝/μgRNA，两者相差80.8倍，变异系数分别为9.5％和7.9％。45例肺部肿瘤中，有12例检出有mdr－1基因不同程度的表达。结论：荧光定量RT－PCR检测mdr?1基因表达方法，检测结果用绝对拷贝数来表示，定量准确可靠，并有利于标准的统一。有1/4未经化疗的肺癌病人有一定水平mdr－1基因的表达。
　　分类号：R730.43　文献标识码：A
　　文章编号：X（00－04
The detection of mdr－1 gene expression using fluorogenic probe quantitative RT－PCR method
GAO Jing－song　et al.
　　（Daan Gene Diagnosis Center of Sun Yat－sen University of Medical Sciences， guangzhou 510089， P.R.China）
　　mA Gang　TONG Ming（Cancer Center of Sun Yat－sen University of Medical Sciences， Guangzhou510060， P.R.China ）
　　Abstract：Objectives： To establish a fluoregenic probe quantitative RT－PCR(FQ－RT－PCR) method for detecting the expression of mdr－1 gene in tumor cells and comprehend the expression of mdr－1 gene in patients with lung cancer. Method： The fluorogenic quantitative RT－PCR method for detecting the expression of mdr－1 gene was established successfully. K562/ADM， k562 cell line or forty－five tumor tissues from patients with lung cancer， were detected in the PE Applied Biosystems 7700 Sequence Detector. Results： after ten duplicate tests with FQ－RT－PCR method， the average level of the mdr－1 gene expression was( 6.86± 0.65)× 10 7copies/μ g RNA from K562/ADM cells and (8.49± 0.67)× 105 copies/μ g RNA from K562 cells， respectively， the former was 80.8 times greater than the latter，the coefficient variation(CV) was 9.5％ and 7.9％ ， respectively. Of forty－five patients with lung cancer， 12 cases expressed of mdr－1 gene at various levels. Conclusions： the mdr－1 gene expression detected with the FQ－RT－PCR could be gotten an accurate quantitative result and the gene expression level be judged easily. moreover， low levels of mdr－1 gene expression were observed in twenty－five percent of the patients with lung cancer.
　　Key words：Fluorogenic quantitative detecting； RT－PCR； mdr－1 gene； Gene expression▲
　　常规检测mdr-1基因表达，多采用竞争RT-PCR法和内源性参比基因RT-PCR定量法[1，2]；它们均属于PCR终点检测法，在PCR扩增的指数期和平台期产量相差极大，很难对起始模板数准确定量。此外，常规的RT-PCR方法还存在因产物污染而导致的假阳性、非特异性扩增、扩增后电泳操作造成误差（对同样的标本可有高达3～10倍的差异）及EB染液对人体有害等问题，妨碍了其在临床中的推广应用。
　　新近出现的荧光定量PCR是PCR技术一个重大突破。该方法是在完全闭管的情况下，对PCR扩增产物进行检测，既彻底杜绝了PCR产物污染造成的假阳性问题，又能够对标本起始模板做到精确定量，已逐步成为PCR更新换代的新技术[3，4]。1997年我们于国内首先建立了荧光定量PCR技术，在此基础上，我们开展了荧光定量RT?PCR检测肿瘤mdr?1基因表达的研究，现报道如下。
　　1　材料与方法
　　1.1　细胞培养
　　K562/ADM（阿霉素）耐药细胞株由福建省肿瘤医院沈世人教授惠赠[5]，K562敏感细胞株来自我校肿瘤医院。两细胞株在RPMI-1640(Gibco)加20％小牛血清，并含青链霉素双抗各100u/ml的培养基中，于37℃、饱和湿度、5％CO2孵箱内连续传代培养；K562/ADM耐药细胞株在培养时加入终浓度为3.8μg/ml的阿霉素。
　　1.2　组织标本
　　45例初治病人肺部肿瘤标本采自我校肿瘤医院，为1998年5月至1998年9月手术后的肿瘤标本，均作病理检查确诊。其中鳞癌19例、腺癌15例、腺鳞癌4例、细支气管肺泡上皮细胞癌4例、肺部转移癌3例。病人年龄39～71岁（平均54.3岁）;男性28人，女性17人。
　　1.3　细胞与组织总RNA的提取
　　将106～107K562/ADM耐药株和K562不耐药株细胞或上述新鲜的肺癌组织0.1～0.2g，分别各加入1mlTrizol（Gibco）试剂，操作按说明进行。提取后的RNA测A260?A280吸光值，要求A260/A280比值≥2.0，并计算出RNA含量。
　　1.4　引物、探针设计、合成、纯化
　　mdr-1参照文献[1]。上游引物5'-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3'，下游引物5'-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3'，扩增片段长度为167bp。自行设计探针如下：5'-CGCT-ACTGAAGCAATAGAAAACTT-3'，其中在5'端标记上荧光发光基团FAM（6-carboxy-fluore-sceinPE公司产品），3'端标记上荧光淬灭基团TAMRA(6-carboxy-tetramethylrhodaminePE公司产品)。引物探针合成纯化在我们实验室完成。
　　1.5　cDNA合成
　　在反应体积为10μl的逆转录管中，含2μg提自K562/ADM耐药株及K562不耐药株细胞的总RNA或病人肿瘤标本，50mmol/LTris－Cl（pH8.3），40mmol/LKCl，7mmol/LMgCl2，1mmol/LDTT，0.01％BSA，1mmol/LdNTPs，20UMMLV逆转录酶（Sangon产品），10URNA酶抑制剂（华美公司产品），各15pmol/Lmdr-1下游引物，37℃，60min，95℃5min灭活逆转录酶。合成好的cDNA置－20℃备用。
　　1.6　定量阳性标准模板的克隆
　　采用T-A载体克隆方案，参照李新波等[6]介绍的方法进行。将mdr-1167bp扩增片段克隆至pUC18质粒中，抽提、纯化重组质粒，按1010拷贝数/μl浓度存于－20℃备用。
　　1.7　荧光定量RT-PCR
　　荧光定量PCR的原理是：在PCR扩增系统中加入一段与靶基因互补的双荧光素标记探针(5'端荧光素称为报告基团，3’端荧光素称为淬灭基团)，在完整状态下探针5’端报告基团发出的荧光受到了3’端淬灭基团抑制而检测不到荧光；当PCR扩增时，随着引物沿模板的延伸，Taq酶具5’-3’的外切酶活性，可将位于扩增片段内的探针5’端的荧光素切下，切下的报告基团脱离了3’端淬灭基团的淬灭作用而发出荧光，切下的荧光素数量与扩增产物是一对一的关系，用检测仪检测荧光值的变化，即可准确判断扩增产物的量[3，4]。在判定结果时，用循环阈值（cyclethreshold，CT）作为临界点，该点位于PCR产物进入指数增长期的起始点。
　　50μlPCR反应体积中，含5XPCR反应液[50mmol/LTris?HCl(pH8.3)、10mmol/LMgCl2、250mmol/LKCl、1mg/ml明胶]10μl，mdr-1上下游引物各15pmol/L，荧光探针10pmol/L，Taq酶3U，和不同样本自100ngRNA逆转得到的cDNA，同时将定量模板梯度稀释，作标准曲线，在ABIPRISM7700型实时检测扩增仪上进行扩增，反应条件为93℃预变性3min，93℃40sec，55℃120sec共作40个循环。反应结束后用计算机将样本与标准曲线对比得出mdr-1基因表达的拷贝数。
　　2　结果
　　2.1　定量阳性标准模板
　　pUC18T载体连接mdr-1PCR片段，经蓝白斑LB平板筛选，含氨苄青霉素80u/mlLB培养基培养，提取质粒后，行PCR扩增，有特异条带出现者，用建立的FQ-RT-PCR法检测，有强烈的荧光值增长，说明mdr?1基因已成功克隆，将提取的质粒测OD值，含量为1.31μg/μl，折算为4.35×1011拷贝数/μl，用TE稀释成1010拷贝数/μl备用。
　　2.2　荧光定量RT?PCR结果
　　PE7700型扩增检测仪在PCR反应进行的同时，每8sec检测一次PCR产物量，做到了实时检测。从图1可见，不同的标准起始模板数（107、106、105、104、103、102、101）在反应后的平台期，产物量相差不成比例，因此，采用终点法进行定量，结果会很不准确。而将检测的临界点定在PCR产物进入指数增长期的起始点即CT值处，由图1可见起始模板数与CT值成比例增长。将不同梯度定量模板数与其CT值关系经对数拟合作图，得到了定量标准曲线，样品与标准曲线比较就能准确反映待检样品的起始核酸量。在最佳反应条件下，1个拷贝起始模板数其CT值约为37～40，100个拷贝CT值约为30.5，因此，反应循环数定为40，可满足最低检测限的要求。
图1　MDR1基因定量标准模板荧光实时定量PCR的动力学曲线
　　荧光定量RT-PCR重复10次检测K562/ADM耐药株和K562不耐药株细胞mdr-1，所得结果为[（6.1，6.2，6.2，6.4，6.5，7.1，7.3，7.4，7.6，7.8）×107]拷贝/μgRNA，和[（7.7，7.8，7.9，8.0，8.2，8.6，8.7，9.2，9.3，9.5）×105]拷贝/μgRNA，平均分别为（6.86±0.65）×107拷贝/μgRNA和（8.49±0.67）×105拷贝/μgRNA，两者之比为80.8，变异系数分别为9.5％和7.9％。所配试剂在?20℃保存半年，无明显变化。
　　在45例肺部肿瘤标本中，有12例检出有mdr-1基因的表达（见表1），表达强度在4.9×102～3.2×105拷贝/μgRNA之间。其中一例来自大肠癌的肺部转移癌mdr-1基因表达量为3.2×105拷贝/μgRNA，追溯病史，该病人4年前患大肠癌，有化疗的经历。去除该例，则这11例病人mdr-1的平均表达量为3.9×104拷贝/μgRNA。
表1　45例肺部肿瘤标本中检出12例mdr－1表达阳性结果
年龄（岁）
荧光定量RT-PCR结果
　　(拷贝/μgRNA)
低分化鳞癌
低分化鳞癌
细支气管肺泡细胞癌
大肠癌肺转移
　　3　讨论　　采用荧光定量RT-PCR方法为制定和统一mdr-1高表达的阈值标准，提供了一个新的思路。与常规PCR相比，荧光定量PCR技术具以下优点：可准确定量待检模板的拷贝数：当荧光信号达到检测点CT值时，PCR反应体系处于最佳的饱和状态，最能反应起始的模板数，克服了常规PCR由于平台效应带来的误差；闭管检测有效防止了因扩增产物污染而导致的假阳性，为该方法用于临床打下坚实基础；引物和探针特异地同目的模板结合，保障了检测的特异性；荧光检测的灵敏度显著高于肉眼观察电泳条带的灵敏度；操作简单、方便、安全、快速，整个过程由电脑控制，从加样到出结果仅需2.5h左右，不存在EB染液或同位素对人体的危害性问题；PE7700型荧光定量PCR仪有96个反应孔，可同时对大量的样品进行检测等[3，4]。荧光定量RT-PCR结果用拷贝数来表示，这种绝对数量显然更准确，易统一标准，这一指标不会因不同的实验室而改变。但采用荧光定量RT-PCR方法判定mdr-1高表达的阈值标准，尚需结合临床耐药标准，对不同的肿瘤进行大量标本的检测后才能得出，而这还需通过多家医院携手合作方可完成。
　　对mRNA用RT?PCR方法进行定量，还需考虑逆转录效率问题。Debuire等[7]曾将cDNA定量标准在体外用T3聚合酶转录成RNA，定量后再作逆转录，这一过程十分繁复，而且需要大量昂贵的T3聚合酶和其它试剂。Cross等[8]建议，在标准化实验条件后，如果是对某种mRNA进行动态监测，即可直接选用DNA作为定量模板。曹丽萍等[2]也指出用RNA作定量模板，其mdr-1mRNA量很少，系列稀释后更易降解，导致结果不稳定，且逆转录需大量昂贵的RNA酶抑制剂和逆转录酶，而用稳定的cDNA作竞争模板，操作简便，省时，也易于贮存，运输和标准化。本实验采用基因克隆的方法构建mdr-1基因cDNA定量模板，具有纯度高，来源广，定量准，安全易控制等优点，可广泛应用于检测。
　　在检测的45例肺癌病人中，发现有25％的初治肺癌病人有不同程度的mdr-1基因表达，mdr-1表达情况与肿瘤的病理分期无明显相关，这一结果同Shin的报道[9]相似。这说明一部分肺癌病人中存在着mdr-1的先天性表达。
　　致谢：张晓实、林正、程钢、周新宇、李虎、许擎等在实验中提供大量帮助，谨致谢意。
　　基金项目：本课题受国家技术创新项目（No：）资助
　　通讯作者：高劲松：ＬTel：86－20－ Fax：86－20－ e－mail：
　　参考文献：
　　［1］Noonan KE， Beck C， Holzmayer TA， et al. Quantitative analysis of mdr? 1 (multidrug resistance)gene expression in human tumors by polymerase chain reaction [J]. Proc Natl Acad Si USA， 1990， 87： 7160～ 7164.
　　［2］曹丽萍，王斌，郁知非.多药耐药基因QRT?PCR检测中内标准DNA和RNA模板的构[J].实验血液学杂志，）：393～398.
　　［3］Heid CA， Stevens J， Livak KJ， et al. Real time quantitative PCR[J]. Genome Res， 1996， 6(10)： 986～ 994.
　　［4］Gibson UE， Heid CA， Williams PM. A novel method for real time quantitative RT? PCR [J]. Genome Res， 1996， 6(10)： 995～ 1001.
　　［5］沈世人，苏颖，黄秀清，等.K562/ADM耐药细胞株的建立及其生物学特性的初步观察[J].癌症，）：222～224.
　　［6］李新波，赵小松，田德志，等.一种PCR产物克隆的新方法—T－A克隆法[J].生物化学与生物物理进展，）：187～189.
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　　［9］Shin HJ， Lee JS， Hong WK， et al. Study of multidrug resistance(mdr1) gene in non small cell lung cancer [J]. Anticancer Res， 1992， 12(2)：367～ 370.
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患者信息：男 50岁 澳门 圣安多尼堂区
代表发病程度大概是乙肝病毒在你体内反转录为mRNA的数目，不是太懂病理。我学生科的，希望下面有高人指导
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