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工业微生物菌种选育技术链霉菌基因工程为什么链霉菌？链霉菌的重要性产生绝大多数已知的抗生素生物合成机制的阐明生产工业用酶的潜力葡萄糖异构酶蛋白酶纤维素酶木聚糖酶。。。WhatAreStreptomyces?TheyareGramPositivefilamentousBacteria.Theyareobligateaerobicbacteriathatareabundantinmostsoils.Streptomyceshavetwometabolicstages,PrimaryandSecondaryMetabolism.Theyutilizeinsolubleorganicdebrisbyproducingavarietyofextracellularhydrolyticenzymes.放线菌生活史StreptomycescoelicolorcolonieswithaerialmyceliumandsporesTheareaofthepicturerepresentsabout2x3cm.Thebluehaloesaroundthecoloniesaresecretedactinorhodin.Actinorhodinisanantibiotic(notusedclinically)whichisblueunderalkalineconditionsandredunderacidicconditions.ActinorhodinisapolyketidemadebymultiplecondensationsofacetatebyaTypeIIpolyketidesynthase(JohnInnesCentre,PhotographyDepartment).YoungvegetativemyceliumYoungvegetativemycelium(c.1umwide)ofStreptomycesgrowninliquidbroth(GabriellaKelemenJohnInnesCentre).MutantcoloniesofStreptomycescoelicolorc.1cmx1cm.Thewild-typecoloniesarecoveredwithgreyaerthereddishmutantcoloniesarenotformingaerialmycelium.TheredmyceliumcolourandthedarkbackgroundisfromtheantibioticsproducedbyStreptomycescoelicolor(JohnInnesCentre,PhotographyDepartment).SinglecolonyofStreptomycescoelicolorSinglecolonyofStreptomycescoelicolortoppedbyaliquiddropletcontainingantbiotic.LiquiddropletsareoftenfoundinStreptomycescolonies,itisnotclearhowtheyaregenerated.(JohnInnesCentre,PhotographyDepartment).CloseupofacolonyofStreptomycescoelicolormutantD132CloseupofacolonyofStreptomycescoelicolormutantD132whichisproducesundecylprodigiosinbutnotactinorhodin(imageprovidedbyKarenJolly,UniversityofLeeds).MassofcurledaerialmyceliumofStreptomycescoelicolorMassofcurledaerialmycelium(c.1umwide)ofStreptomycescoelicolor.(Scanningelectronmicrograph,MarkButtner,KimFindlay,JohnInnesCentre).AerialmyceliumandsporeofStreptomycescoelicolorThemyceliumandtheovalsporesareabout1umwide,typicalforbacteriaandmuchsmallerthanfungalhyphaeandspores.(Scanningelectronmicrograph,MarkButtner,KimFindlay,JohnInnesCentre)
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金色链霉菌接合转移体系的构建
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3秒自动关闭窗口黑暗链霉菌选育及其生物合成信息流阻断的探索--《福州大学》2010年硕士论文
黑暗链霉菌选育及其生物合成信息流阻断的探索
【摘要】：黑暗链霉菌是重要的氨基糖苷类抗生素——安普霉素和妥布霉素的产生菌，为不断提高其发酵单位，采用常规育种手段进行选育，获得了高产菌株。为进一步提高产生菌的质量，拟采用现代基因工程技术，阻断不同组分的生物合成信息流，以期获得单组分工程菌。以敲除妥布霉素生物合成相关基因tobS1-tobC为目标，完成相关接合转移质粒的构建，并对接合转移体系进行初步研究。
黑暗链霉菌出发菌株Ts-228，经自然分离、紫外诱变和耐自身代谢产物处理，琼脂块法初筛结合摇瓶发酵来筛选高产菌，获得了效价提高1.8倍的新菌株Tt-49。该菌株生长周期4天，传代稳定。种龄为18h左右，接种量10％。于50L罐上发酵绘制代谢曲线，按照该曲线图进行调控，发酵单位可稳定在5000u/mL以上，最高达5865u/mL。自然分离与诱变相结合，是黑暗链霉菌选育的有效途径。菌株经紫外诱变和耐受驯化，发酵单位显著提高，所得的高产菌株已用于工业化生产。溶氧是妥布霉素发酵生产中的重要调控因子。
以质粒pBR322、pUC19和pIJ773为基础，构建出含四环素抗性基因的重组质粒pIJ791，为后续黑暗链霉菌相关基因的敲除提供了筛选标记。同时去除了质粒pIJ773上多余的SacI酶切位点，可作为基因替换的母质粒。
利用PCR的方法，以黑暗链霉菌Tt-49基因组DNA为模板，扩增tobS1-tobC上游片段和下游片段作为同源交换臂，两端携带FRT重组臂的四环素抗性基因作为筛选标记，插入到质粒pKC1139中，构建接合转移质粒pKC1150。CaCl2法制备供体菌ET12567/pUZ8002/pKC1150。初步考察了将穿梭载体pKC1150导入黑暗链霉菌的适宜条件后，成功将pKC1150转入到黑暗链霉菌Tt-49中。为下一步阻断妥布霉素生物合成基因簇上tobC基因（编码2-脱氧青蟹肌醇合酶）和tobS1基因（编码2-脱氧-青蟹肌醇转氨酶）奠定了基础。
【关键词】：
【学位授予单位】：福州大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2010【分类号】：Q93【目录】：
中文摘要3-4Abstract4-6缩略词6-7目录7-11第一章 绪论11-22 1.1 黑暗链霉菌简介11-14
1.1.1 暗霉素的发现11
1.1.2 暗霉素结构与理化性质11-13
1.1.3 暗霉素主要成分药理及应用13-14 1.2 黑暗链霉菌研究进展14-20
1.2.1 菌种改良14-15
1.2.2 发酵控制15-16
1.2.3 提取精制16
1.2.4 生物合成基因克隆16-20 1.3 立题依据和研究内容20-22第二章 暗霉素高产菌株选育及其发酵特性研究22-33 2.1 实验材料22-23
2.1.1 菌种22
2.1.2 培养基22-23
2.1.3 试剂23
2.1.4 仪器与设备23 2.2 实验方法23-26
2.2.1 培养基与缓冲液的制备23-24
2.2.2 孢子活计数24
2.2.3 培养条件24
2.2.4 耐自身代谢产物的处理24
2.2.5 琼脂块法24
2.2.6 相关参数测定方法24-26 2.3 结果与讨论26-32
2.3.1 出发菌株的考察26
2.3.2 紫外诱变处理26-27
2.3.3 耐自身代谢产物筛选27
2.3.4 菌株 Tt-49 生长特性考察27-29
2.3.4.1 斜面培养时间的确定27-28
2.3.4.2 传代对生产力稳定性的影响28
2.3.4.3 冷藏对稳定性的影响28-29
2.3.5 种子特性考察29-30
2.3.5.1 种龄的确定29-30
2.3.5.2 接种量的确定30
2.3.6 溶氧对发酵单位的影响30-31
2.3.7 发酵代谢曲线的绘制31-32 2.4 小结32-33第三章 阻断妥布霉素生物合成信息流的探索33-62 3.1 材料与方法36-39
3.1.1 菌种和质粒36-37
3.1.2 培养基37-38
3.1.3 试剂38-39
3.1.3.1 主要溶液38
3.1.3.2 主要生化试剂38-39
3.1.4 主要仪器和设备39 3.2 实验方法39-45
3.2.1 菌种制备39
3.2.2 链霉菌染色体 DNA 的提取39-40
3.2.3 PCR 扩增反应40-41
3.2.4 DNA 电泳检测41
3.2.5 DNA 片段回收41
3.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备41-42
3.2.7 大肠杆菌质粒转化42
3.2.8 碱变性法微量制备质粒42-43
3.2.9 大肠杆菌质粒的纯化43
3.2.10 酶切酶连反应及回收43-44
3.2.11 去磷酸化反应44
3.2.12 接合转移及接合频率的计算44-45 3.3 结果与讨论45-60
3.3.1 S.tenebrarius Tt-49 对抗生素敏感性的考察45
3.3.2 四环素抗性基因的克隆45-46
3.3.3 四环素抗性重组质粒 pIJ791 的构建46-48
3.3.3.1 pIJ791 的构建策略46-47
3.3.3.2 pIJ791 中间质粒的酶切验证47
3.3.3.3 pIJ791 对四环素抗性的验证47-48
3.3.4 PCR 扩增 tobS1-tobC 上下游基因同源片段48-51
3.3.4.1 菌株 S.tenebrarius Tt-49 基因组 DNA 的提取48-49
3.3.4.2 PCR 引物设计49-50
3.3.4.3 PCR 反应50-51
3.3.5 妥布霉素阻断载体 pKC1150 的构建51-56
3.3.5.1 穿梭载体的选择51-53
3.3.5.2 pKC1150 的构建流程53-54
3.3.5.3 pKC1150 中抗性片段的克隆54-55
3.3.5.4 pKC1150 中间质粒的酶切验证55-56
3.3.5.5 pKC1150 的鉴定及接合转移供体菌的制备56
3.3.6 供体菌与 S.lividans TK24 间的接合转移56-57
3.3.7 供体菌与 S.tenebrarius Tt-49 间的接合转移57-60
3.3.7.1 孢子热激时间和温度的考察57
3.3.7.2 孢子接合转移时间的考察57-58
3.3.7.3 供体菌与受体菌比例的确定58
3.3.7.4 萘啶酸和四环素覆盖时间的影响58
3.3.7.5 接合子的初步检测58-59
3.3.7.6 同源重组情况的预测分析59-60 3.4 下一步工作建议60-61 3.5 小结61-62全文总结62-63致谢63-64参考文献64-68个人简历68-69附录69-84
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