Smad泛素化调节因子-2及其mRNA在增生性瘢痕组织中的表达--《中华损伤与修复杂志(电子版)》2009年05期
Smad泛素化调节因子-2及其mRNA在增生性瘢痕组织中的表达
【摘要】：目的研究烧伤后增生性瘢痕组织中Smad泛素化调节因子-2(Smurf2)及其mRNA的表达。方法选取烧伤后增生性瘢痕患者9例,取材于患者整形手术切除的瘢痕,同时取同一患者剩余正常皮肤作为对照。Westernblotting方法检测Smurf2蛋白水平,RT-PCR检测其mRNA表达;进一步分离培养人正常皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞,加入外源性转化生长因子β1(TGF-β1)刺激,观察Smurf2蛋白和mRNA水平的变化。结果增生性瘢痕组织中Smurf2蛋白水平和mRNA表达显著高于正常皮肤(P0.05),而且,在外源性TGF-β1刺激下,瘢痕成纤维细胞中Smurf2蛋白和mRNA表达呈时间依赖性增加。结论烧伤后增生性瘢痕组织中Smurf2及其mRNA表达增强;在TGF-β1刺激下,瘢痕成纤维细胞中Smurf2及其mRNA表达逐渐增加。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R622【正文快照】：
转化生长因子β1(transforming growth factor beta-1,TGF-β1)在增生性瘢痕形成过程中起着关键性的作用。TGF-β1通过细胞内信号转导通路发挥作用,而Smad是其目的基因转录的主要信号转导蛋白。Smad泛素化调节因子-2(Smad ubiquitination regulatory factor2,Smurf2),是一种E
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京公网安备75号增生性瘢痕和正常皮肤组织成纤维细胞培养上清的蛋白质组学研究--《第三军医大学》2009年博士论文
增生性瘢痕和正常皮肤组织成纤维细胞培养上清的蛋白质组学研究
【摘要】：
增生性瘢痕(hypertrophic scar)是皮肤的纤维增殖紊乱疾病,通常发生于皮肤严重创伤和烧伤后。增生性瘢痕不仅影响患者的外观,而且会严重影响患者的心理健康和功能,使患者的生活质量显著下降,给患者家庭、社会带来了沉重的经济负担。
增生性瘢痕的主要特点是细胞外基质的过度沉积。由于绝大部分的实验动物比如大鼠、兔子、小鼠和猪不能形成增生性瘢痕,因此增生性瘢痕的研究一直都比较困难。
以前的研究表明,相比正常皮肤的成纤维细胞,增生性瘢痕组织来源的成纤维细胞分泌更多细胞外基质蛋白(Ⅰ型和Ⅲ胶原等)、蛋白多糖(versican和biglycan等)以及生长因子(TGF-β和胰岛素样生长因子等),但是表达较低的重塑酶,包括胶原酶和其它的基质金属蛋白酶以及小蛋白多糖decorin等。因此成纤维细胞在增生性瘢痕的形成中起着非常关键的作用。
细胞自身分泌的细胞因子对细胞自身的功能有着重要的作用,影响细胞自身的增值、分化、迁移以及其它的多种功能。因此,在本实验中,我们选择增生性瘢痕组织来源的成纤维细胞和正常皮肤来源的成纤维细胞的培养上清为研究对象,找出两种上清的差异蛋白,以期找到与皮肤瘢痕增生密切相关的蛋白,为探讨瘢痕的形成机制以及治疗和预防瘢痕打下初步的基础。
1.正常皮肤组织和增生性瘢痕组织的成纤维细胞的分离培养:
正常皮肤组织来源于西南医院泌尿外科包皮组织,增生性瘢痕组织来源于西南医院烧伤研究所烧伤患者。正常成纤维细胞来自本院泌尿外科,增生性瘢痕成纤维细胞来自我所烧伤后一年内患者。分离与培养方法如下:将组织块放入无菌培养皿内,PBS冲洗三遍,无菌剪刀除去表皮部分,剪碎皮下组织;将剪碎后的组织放入25mL锥形培养瓶内,加入0.5%胰酶10mL,室温,轻微振荡2h;加入10mL 10%小牛血清DMEM终止消化,将悬液通过无菌滤网过滤后弃去组织碎片;离心,400g/min×10min,弃上清,加入10mL 10%小牛血清DMEM洗三遍,再次离心;弃上清后,重悬细胞于10mL10%小牛血清DMEM中,移至75cm2培养瓶中,37℃,5% CO2培养箱内进行培养,24h后更换培养基,同时除去未贴壁细胞。待细胞完全长满后,即可进行传代培养。实验时选用第6代左右的成纤维细胞。
2.两种细胞培养上清的收集和分离:
用无血清培养基培养两种细胞六天后,收集培养上清,3000rpm,离心10min,收集上清,然后加入4倍体积–20℃预冷的丙酮,–20℃过夜后,12000rpm,离心30min,弃上清,待丙酮充分挥发后,将蛋白溶于裂解缓冲液,采用Bradford方法进行蛋白定量,然后用10%的SDS-PAGE将上清蛋白分离。
3.蛋白胶内酶解:
将含有目的带白的条带切下,胶条片断脱色,冲洗,在二硫苏糖醇还原以及碘乙酰胺烷化后,蛋白在37°C用胰蛋白酶消化过夜。用30%乙腈、0.3%三氟乙酸(TFA)、以及100%乙腈将得到的胰蛋白酶肽从胶条片断中提取出来。
4.质谱鉴定和分析:
采用HPLC-CHIP-MS/MS鉴定酶解肽段,质谱仪参数:分离器电压设置在40.0 V;Cap Exit为250.2 V;Oct1 DC为12.0 V;Oct2 DC为4.62 V;Trap Drive为85.0;Oct RF为216.3 VLens 1设置为–5 V,Lens 2为–60 V。采用Spectrum Mill(Rev A.03.02.060; Agilent)搜索引擎软件进行数据分析。根据使用说明书,以胰酶为蛋白酶,在默认的条件下获得原始数据,然后在swiss-prot数据库中搜索针对人的蛋白数据库,允许有两个不完全裂解位点,且包括在搜索中氧化甲硫氨酸和N-末端谷胺酰胺转化成5-氧-2-吡咯烷羧酸的变量修正。如果前向-逆转得分大于2,列1-列2得分大于2,得分阈值大于7.67,得分百分比峰强度大于70%,我们认为肽段是有效的。只有当蛋白具有两个或两个以上的有效肽段、总得分大于25的时候,进行报告。
5. GO分析:
通过GO分析,找出上清中的分泌型蛋白以及细胞外基质蛋白,并对这些蛋白进行初步的功能分析。然后查询相关的文献和数据库,找出与增生性瘢痕形成相关的蛋白。
6.回复性验证:
通过Western Blotting回复性验证前胶原C内肽酶增强子1在两种上清中的表达情况。通过免疫组化检测其在正常皮肤组织和增生性瘢痕中的表达情况。
1.通过HPLC-CHIP-MS/MS鉴定,正常皮肤成纤维细胞培养上清共鉴定出82个蛋白,瘢痕组织来源的鉴定出79个蛋白。经过GO注释,正常皮肤来源的成纤维细胞的上清内有43个蛋白被注释为胞外蛋白,瘢痕来源的有37个。通过比较发现两种细胞共同分泌的蛋白有25个,瘢痕组织成纤维细胞特异性分泌的有12个,正常皮肤的有18个。
2.通过GO注释,我们对两种细胞分泌蛋白的功能进行了初步分析。从图2可知,两种成纤维细胞分泌蛋白主要具有结合功能,分别为41个和33个蛋白,占各自总分泌蛋白的95.3%和89.2%。正常成纤维细胞分泌蛋白分别有9个(20.9%)具有信号转导和结构分子功能,瘢痕组织的分别为5个(13.5%)和10个(27%).两种细胞分别有8个(18.6%)和9个(24.3%)蛋白具有催化活性。正常皮肤的成纤维细胞分别有1个蛋白具有转运和抗氧化活性,而瘢痕组织的成纤维细胞有6个具有酶调节活性。
3.通过生物信息学分析和查询相关的数据库以及参考文献,我们认为Vasorin蛋白和前胶原C内肽酶增强子1(Procollagen C-endopeptidase enhancer 1)与瘢痕的形成有关。
4.通过WB,对前胶原C内肽酶增强子1进行了回复性验证,证实了前胶原C内肽酶增强子1瘢痕组织来源的成纤维细胞培养上清中高表达,而在正常皮肤培养上清中不表达。免疫组化结果表明其在正常皮肤组织上皮高表达而在瘢痕组织上皮中低表达。
通过收集培养上清和HPLC-CHIP-MS/MS鉴定,我们建立了瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞的分泌蛋白谱,并对其功能进行了初步的分析。通过对比增生性瘢痕组织和正常皮肤组织来源的成纤维细胞的培养上清,我们认为增生性瘢痕组织来源的成纤维细胞表达的Vasorin蛋白、前胶原C内肽酶增强子1与瘢痕组织的形成有密切的关系,为进一步阐明增生性瘢痕组织的发生机制和临床干预打下了初步的基础。
【关键词】：
【学位授予单位】：第三军医大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2009【分类号】：R751【目录】：
英文缩写一览表5-6
英文摘要6-10
中文摘要10-13
第一部分 增生性瘢痕和正常皮肤组织成纤维细胞培养上清的蛋白质组学研究13-40
材料与方法13-20
参考文献38-40
第二部分 Jurkat T 细胞质膜蛋白组学研究初探40-56
材料与方法40-44
参考文献54-56
全文结论56-57
文献综述 质膜蛋白质组学58-80
参考文献70-80
研究生期间撰写论文情况80-81
附表81-116
英文论著116-129
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京公网安备75号增生性瘢痕组织中成纤维细胞活性功能研究△
中国修复重建外科杂志 1998年第2期第12卷 实验研究
作者：赵烨德1　牛星焘1　肖军军2
单位：1　北京医科大学附属第三医院成形科(北京，100083)；2　北京医科大学基础部细胞生物教研室
关键词：增生性瘢痕；成纤维细胞；细胞核增殖抗原
　　摘　要　　为全面系统了解瘢痕增生过程中成纤维细胞的活性功能状况，实验通过40例不同时期的瘢痕增生组织进行成纤维细胞核内增殖抗原(PCNA)、核仁组成区嗜银蛋白(AgNORs)和氨基酸分析检测。结果发现：PCNA的蛋白表达主要在1和3个月时期的瘢痕成纤维细胞核内，细胞内AgNORs在1个月～9个月瘢痕增生组织中明显高于12个月以后的瘢痕组织及正常皮肤内水平；组织总氨基酸量随瘢痕增生发展逐渐递增，但以瘢痕增生1个月时期为最快(206.74 μg/mg组织)，代表胶原含量的羟脯氨酸则在瘢痕发展3个月～6个月之间提高最快(17.05 μg/mg组织)，6个月～9个月之间下降为5.11 μg/mg组织，9个月～12个月为1.31 μg/mg组织。由此提示：在瘢痕发展整个过程中，成纤维细胞的增殖旺盛阶段在瘢痕形成早期，胶原蛋白沉积在6个月时期左右也基本完成，但其它细胞外间质如胶原蛋白，蛋白多糖纤维结合蛋白等在12个月以后的瘢痕组织中仍有聚集。
　　STUDY ON THE ACTIVITY OF FIBROBLAST IN HYPERTROPHIC SCAR/Zhao Yede, Niu Xingtao, Xiao Junjun. Department of Plastic Surgery, the Third Affiliated Hospital of Beijing Medical University, Beijin, P. R. China 100083
　　Abstract　　To determine the state of fibroblast during the process of development of hypertrophic scar (HS), 40 specimens of HS in different periods were collected. The expressions of prolifrating cell nuclear antigen (PCNA) and Ag-protein in nucleolar organizer regions (Ag NORs) as well as the content of total amino acids in the tissues were examined. The hypertrophic scar of 1st and 3rd month old, the expression of PCND and Ag NORs were the highest. In the 9th and 12th month old, althrough PCNA was nearly negative, but the expression of Ag NORs was low. The content of total amino acid was increased gradually as HS developed but the increase of amount of hydroxyproline was markedly slowed down in 9 month old HS. It was suggested that: (1) in the developing process of HS the proecess of overproliferation of fibroblasts was short and limitted in 1-3 months period in the proc (2) the synthesis of collagen was nearly stopped at 6 months, but that of other extracellular matrix such as fibronectin and proteoglycan might be continued to aggregate after 12 months.
　　Key words　　 Hypertrophic scar　　Fibroblast　　Proliferating cell nuclear antigen
　　成纤维细胞作为导致增生性瘢痕组织病理学改变的主要角色，一直是们研究的热点。在以前的实验研究中，我们已经发现瘢痕组织内免疫细胞的过度浸润，细胞因子的表达与组织增生发展有着密切的联系。为进一步明确细胞因子的作用，并全面了解成纤维细胞的活性功能，选择不同时期增生性瘢痕组织40例，进行成纤维细胞核内增殖抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和核仁组成区嗜银蛋白(Ag-protein in nucleolar organizer regoins, AgNORs)表达检测；组织内羟脯氨酸及总氨基酸含量分析。报道如下。
　　1　材料与方法
　　1.1　组织来源
　　增生性瘢痕组织40例，其中增生1个月6例，3个月6例，6个月8例，9个月7例，12个月13例；正常皮肤组织6例。标本均取自北京医科大学附属第三医院成形科住院患者，年龄20岁～40岁。取材前患者无长期外用瘢痕防治药物史，不伴肿瘤及其它严重疾患。
　　1.2　主要试剂及配制
　　鼠抗PCNA单克隆抗体，SP试剂盒购自北京中山生物公司； 酸化液： 1份36%乙酸和3份无水乙醇混合物；工作液Ⅰ：2g明胶溶于1%甲酸液中；工作液Ⅱ：50%硝酸银液；定影液：5%硫代硫酸钠液。
　　1.3　方法
　　1.3.1　PCNA蛋白检测　液氮保存组织标本，在恒温冷冻切片机上制成5 μm～10 μm冰冻切片，载玻片须先用APES脱片剂处理，组织切片4%多聚甲醛固定20分钟，PBS清洗3%，H2O 10分钟，二抗血清37℃ 20分钟，1∶200 PCNA单抗37℃ 1小时，二抗及SP复合物37℃各45分钟，DAB加1%AgNO3 5分钟，脱水，透明，封片观察。
　　1.3.2　AgNO3检测　4 μm石蜡组织切片脱蜡至去离子水5分钟3次；酸化液5分钟，去离子水重复3次各5分钟，银染；工作液Ⅰ和工作液Ⅱ按1∶2比例临用前混合，滴于切片上，30分钟，避光，去离子水洗；定形；5%硫代硫酸钠2分钟，水洗，脱水，透明，封片观察。
　　1.3.3　氨基酸分析　新鲜组织标本60℃烘烤24小时～48小时，干燥后标量，置18 mm×180 mm试管中，加6mol/L HCl 0.5 ml/mg组织；充氮，封口，110℃水解20小时～24小时，冷却，氧化二磷干燥，再准确加0.2 mol/L HCl至1 ml，上样于氨基酸分析仪中，自动测定。
　　2　结果
　　2.1　PCNA
　　PCNA最早是从SLE血清中为自身抗体所识别的见于增殖核内的抗体成份得以认识的；观察证明，PCNA与细胞周期是同一物质，在功能上属于DNA聚合酶辅蛋白，在细胞周期调节中具有重要作用。我们利用PCNA单抗作PCNA表达免疫组化检测，为增加反应对比度，在DAB显色剂中加入1% AgNO3，阳性信号呈黑色。结果显示：1个月～3个月瘢痕增生组织的成纤维细胞核内可见高密度黑色阳性信号；6个月时期的瘢痕组织中，在胶原结节内的成纤维细胞内表达弱，而胶原结节间隙中的成纤维细胞核内仍有较强表达；12个月以后瘢痕及正常皮肤的成纤维细胞内PCNA表达均很弱(图1 a，b)。
　　2.2　AgNORs
　　实验通过带负电荷的羧基，银离子与嗜银蛋白相互结合，使银离子还原成金属银，形成在亚显微镜下看得见的微小核心，并以此作为银继续沉淀的集中部位，然后由较少负电荷的硫氢基吸引银，使微小银发展成特征性黑点。实验发现，在不同时期瘢痕组织及正常皮肤标本中，均有大小不等，密度不均的黑点信号(图2，3)。借助计算机图像处理系统，测得成纤维细胞核内平均银染灰度值见表1。
　　统计结果表明：在增生性瘢痕发展过程中，AgNORs在1个月～9个月时期明显高于12个月时期及正常皮肤内含量，在1个月～9个月之间，1，3个月时期又明显高于6，9个月时期(P＜0.01)，但1个月与3个月，6个月与9个月，12个月与正常皮肤之间AgNORs量无显著差异(P＞0.05)。
　　2.3　氨基酸分析
　　每例标本必须彻底烘干，精确称量，其中重量最好不超过5 mg，必要时分成几小块，各期瘢痕组织及正常皮肤通过氨基酸自动分析仪测得羟脯氨酸及总氨基酸量，结果如表2所示。可见随增生性瘢痕发展，羟脯氨酸及总氨基酸在组织内有不同程度升高，各期之间作组织t检验表明，羟脯氨酸量在9个月与12个月瘢痕组织之间无显著性差异，其余各组间差异明显(P＜0.01)，而总氨基酸量在各组间均有显著差异(表3)。
图1　免疫组化染色标记的PCNA(×100)
　　a　1个月的瘢痕　b　6个月的瘢痕
图2　组织化学染色标记的AgNORs(×400)
　　a　1个月的瘢痕　b　3个月的瘢痕
图3　组织化学染色标记的AgNORs(×400)
　　a　9个月的瘢痕　b　12个月的瘢痕
表1　各时期组成纤维细胞AgNORs的光密度()±s)
0.297 5±0.039 1
0.392 4±0.028 0
　0.397 6±0.087 1
0.358 2±0.034 0
0.358 3±0.038 5
0.300 5±0.032 8
表2　正常皮肤及各期瘢痕组织的羟脯氨酸和总氨基酸水平(μg/mg，±s)
羟脯氨酸　
43.67±　1.71
54.41±　2.23
67.53±　3.02
84.58±　2.36
89.69±　4.20
91.00±　1.84
548.34±12.40
755.08±14.51
837.97±13.09　
893.16±19.60
956.95±13.87
986.51±17.85
表3　相应连续时间点之间羟脯氨酸和总氨基酸的增加量(μg/mg)
羟脯氨酸　
　　3　讨论
　　成纤维细胞活性功能在增生性瘢痕发生、发展过程中具有重要的作用。成纤维细胞的活性功能包括增殖分化功能和细胞外基质的合成、分泌功能。从目前所能查阅的文献中，我们还没有发现定为测定瘢痕组织中成纤维细胞增殖活性的方法。众所周知，在细胞周期中，一些蛋白质的合成对于细胞由G0/G1期进入S期(DNA合成期)是必不可少的，如降钙素、非组蛋白、染色体蛋白和PCNA等。PCNA又称周期蛋白(cyclin)，首先由Miyachi提纯［1］。研究表明，PCNA本质是一种DNA聚合酶的附属蛋白，它的出现明显与细胞增殖有关，在静止细胞，其量很少，G1晚期开始增加，S期达到高峰，G2、M期明显下降［2，3］。目前，PCNA已成为了解细胞增殖活性状态的重要指标。我们的实验结果表明，在1和3个月增生性瘢痕组织中PCNA表达率最高，6个月时期组织内PCNA表达大多集中于皮下浅层及胶原结节间隙的成纤维细胞核内，以后组织内表达明显下降。正常皮肤组织的PCNA表达仅存在于部分基底细胞核内。说明，在早期组织中成纤维细胞处于旺盛增殖时期，6个月时期开始下降，9个月以后瘢痕中成纤维细胞几乎不再增殖。至于早期瘢痕组织中成纤维细胞大量增殖的原因，我们认为与免疫细胞的过度及IL-1β、TGF-β的过度表达有关。
　　成纤维细胞对增生性瘢痕形成的另一大“贡献”就是分泌大量细胞外基质(extracellular matrix，ECM)。ECM成分包括不同类型胶原蛋白、各种蛋白多糖、弹性蛋白以及一些粘连蛋白［4，5］。但在增生性瘢痕组织中ECM主要是胶原蛋白、蛋白多糖和纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)。对瘢痕组织ECM的研究以往很少见到有系统的报道，我们通过氨基酸分析仪，测定各时期组织内细胞外基质蛋白和细胞结构蛋白经特殊处理后降解为游离氨基酸的含量。结果发现，绝大部分游离氨基酸含量随瘢痕发展逐渐增加，氨基酸总量也呈不同程度的升高。游离氨基酸中的羟脯氨酸，作为胶原蛋白的特异性氨基酸，其含量具有间接反映胶原含量的作用。因此，每一时期的羟脯氨酸量可反映出此时胶原的沉积状况，各时期之间的羟脯氨酸升高量就大致代表胶原蛋白新合成和分泌的量。羟脯氨酸在6个月以前各期之间升高比较稳定，其中以3个月～6个月之间升高最明显(17.05 μg/mg组织)，说明3个月～6个月为胶原合成的高峰期；6个月～9个月时期升高幅度则明显下降(5.11 μg/mg组织)，9个月～12个月之间平均只升高1.31 μg/mg组织。统计结果进一步表明，6个月和9个月时期的羟脯氨酸量两者有显著性差异，而9个月与12个月时期两者的羟脯氨酸量则无显著性差异。说明在瘢痕发展整个过程中，成纤维细胞合成和分泌胶原蛋白的能力于6个月以前为最强，胶原在组织中沉积基本上至9个月时期已完成。
　　总氨基酸量反应了组织内蛋白质含量。组织内蛋白质包括组成细胞的结构蛋白和细胞外基质蛋白，从我们的实验结果中可以看出，1个月时期组织内总氨基酸量与正常皮肤相比，平均升高206.74 μg/mg组织，幅度最大；3个月～6个月之间升高了55.19 μg；而6个月～9个月之间则升高了63.79 μg。值得注意的是，在细胞增殖和胶原合成研究中我们已经证实：成纤维细胞在6个月以后的增殖能力明显低于6个月以前，胶原新合成量由3个月～6个月的17.05 μg下降至5.11 μg，但氨基酸总量却为何出现“反弹”现象呢?而且在9个月～12个月时期仍有29.56 μg/mg组织的增加量。我们认为，尽管6个月以后瘢痕组织内成纤维细胞合成胶原蛋白的能力明显下降，但其它细胞外基质如蛋白多糖、FN等仍有可能在不断合成分泌，从而导致组织总氨基酸含量的升高。至于1个月时期大幅度升高原因，一方面与组织内大量细胞外基质沉积有关，但更主要的是伤后有大量成纤维细胞增殖造成细胞结构蛋白含量明显增加。
　　为了进一步证实在6个月以后的瘢痕组织内成纤维细胞仍具有分泌大量细胞外基质蛋白的能力，我们利用AgNORs的特点，研究细胞增殖、蛋白质的合成能力。核仁组成区(nucleolar organizer regions, NORs)是DNA的袢，它具有核糖体RNA基因，而AgNORs是核仁组成区上的嗜银非组蛋白［6，7］。NORs是DNA转录的调节者，并维持DNA呈伸展状态，它的数量和大小反应诱导分化的能力及NORs的转录活性［8，9］。理论上，类二倍体细胞的核DNA合成以后，应该显示20对AgNORs的位置，但它们能否检查出来取决于NORs的转录活性，该型携带NORs的染色体数量以及细胞所处的周期阶段，但AgNORs的增加又与细胞增殖或蛋白转录活性有关。由于我们采用的标本为组织切片，实验结果反映的AgNORs不能完全代表核内AgNORs数量，因此为排除系统误差，我们借助图像分析检测相同时期成纤维细胞平均银染面积的光密度值。从表1中不难看出各个时期细胞的AgNORs量均高于正常皮肤组织中的量，但只有12个月时期组与正常皮肤组无显著性差异(P＞0.05)。各时期组之间比较发现，1个月组与3个月组，6个月组与9个月组之间二者均无显著性差异，3个月组与6个月组，9个月组与12个月组之间又有显著性差异。我们认为，3个月～6个月之间的差异可能与细胞增殖有所下降有关，6个月～9个月之间无显著差异，说明成纤维细胞尽管增殖功能下降，但蛋白转录功能无明显改变，说明在9个月时期瘢痕组织内成纤维细胞仍有较强的蛋白合成能力，这无疑使细胞外基质进一步得以沉积，组织内氨基酸总量也随之升高。因此，细胞外基质沉积是一个长时间聚积过程。
4　参考文献
　　1　Miyach K, Frizier MJ, Tan EM. Autoantibodies to a nuclear antigen in proliferating cell. J Immunol, ):2228
　　2　Prelich G, Tan CK, Kostura M. Blundell PA et al. Functional identity of proliferating cell nuclear antigen and a DNA polymerase- auxiliary protein. Nature, 3):517
　　3　Rodrgo B, Heather MB. Existence of two population of cyclin/proliferating cell nuclear antigen during the cell cycle: Association with DNA replication site. J Cell Biol, ):1549
　　4　李　玉主编．细胞外间质的生物化学及研究方法．北京：民卫生出版社，～148
　　5　Rockwell WB, Cohen IK, Ehrlich HP et al. Keloid and hypertrophic scars: A comprehensive review. Plast Reconstr Surg, ):827
　　6　Ploton D. Improvenent if the staining and in the visualization of the argyrophilic protein of the nucleolar organizer region at the optical level. Histochem J, ):5
　　7　William MA, Turgen AK, Krohne G et al. Argyrophilic nuclear and nucleolar protein of xenopus laevis oocytes identified by gel electrophresis. Exp Cell Res,
　　8　Crocker J. Nucleolar organizer regions in lymphomas. J Pathol, ):151
　　9　Egam M, Rafat F, Crocker J et al. Prognostic importance of nucleolar organizer regions in ewing s scarcoma of childhood. J Clin Pathol, ):232
　　△　国家自然科学基金资助项目
（收稿：）
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