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实验五、无菌操作及接种技术
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认识无菌实验室
【来源/作者】北纳创联生物技术研究院 【更新日期】 9:38:12
一、无菌室
无菌室（洁净室）是微生物检测的重要场所和最基本的设施。它是微生物检测质量保证的重要物质基础。微生物实验室洁净室的设计、施工、安装、验收应按国家相关标准执行。
对于微生物检测工作者来说，大量的工作是进行正常管理和日常的使用。无菌室的标准要符合ＧＭＰ洁净度标准要求。
１?无菌室的基本框架
无菌室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区（图１-１）。面积一般不超过１０ｍ２，不小于５ｍ２；高度不超过２．４ｍ。由１～２个缓冲间、操作间组成（操作间和缓冲间的门不应直对），操作间和缓冲间之间应具备灭菌功能的样品传递箱。在缓冲间内应有洗手盆、毛巾、无菌衣裤放置架及挂钩、拖鞋等，不应放置培养箱和其他杂物；无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。操作间内不应安装下水道。
无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，操作区洁净度１００级或放置同等级别的超净工作台，室内温度控制在１８～２６℃，相对湿度为４５％～６５％。缓冲间及操作室内均应设置能达到空气消毒效果的紫外灯或其他适宜的消毒装置，空气洁净级别不同的相邻房间之间的静压差应大于５Ｐａ，洁净室（区）与室外大气的静压差应大于１０Ｐａ。无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于３００ｌｘ。缓冲间和操作间所设置的紫外线杀菌灯（２～２．５Ｗ／ｍ３），应定期检查辐射强度，要求在操作面上达４０μＷ／ｍ２。不符合要求的紫外杀菌灯应及时更换。
２?无菌室的使用登记制度
微生物检测检验室都要建立使用登记制度。在登记册中可设置以下项目内容：使用日期、使用时间、使用人、设备运行状况、温度、湿度、洁净度状态（沉降菌数、浮游菌数、尘埃粒子数）、报修原因、报修结果、清洁工作（台面、地面、墙面、天花板、传递窗、门把手）、消毒液名称等。
３?无菌室的管理
建立使用标准操作规范（ＳＯＰ）并严格管理，需特别注意以下几点：
（１）规定净化系统运转时间：要求每次实验前应开启净化系统，使运转至少１ｈ，同时开启净化台和紫外灯，紫外灯照射时间不少于３０ｍｉｎ。
（２）物品进入无菌室基本要求：凡进入无菌室的物品必须先在第一缓冲间内对外部表面用消毒剂消毒灭菌，再经物流缓冲间、传递窗１ｈ以上，及无菌空气吹干后送入无菌室。注意带纤维、易发尘物品不得带进净化实验室。无菌室内固定物品不得任意搬出。
（３）人员进入无菌室要求：实验人员进入无菌室不得化妆、戴手表以及戴戒指等首饰；不得吃东西、嚼口香糖。应清洁手后进入第一缓冲间更衣，同时换上消毒隔离拖鞋，脱去外衣，用消毒液消毒双手后戴上无菌手套，换上无菌连衣帽（不得让头发、衣等暴露在外面），戴上无菌口罩。然后，换或是再戴上第二副无菌手套，在进入第二缓冲间时换第二双消毒隔离拖鞋。再经风淋室风淋３０ｓ后进入无菌室。
（４）温湿度观察要求：观察温度计、湿度计上显示的温湿度是否在规定的范围内，并作为实验原始数据记录在案。如发现问题应及时寻找原因，及时报修和及时报告实验室主管，并将报修原因和结果记录归档。
（５）沉降菌落计数与浮游菌测定要求：在每次实验同时，对操作室和层流台做微生物沉降菌落计数，将结果记录在使用登记本上，并作为实验环境原始数据记录在实验报告上。每周１次，或在无菌检查时，以及在每次实验时，对操作室和净化台进行浮游菌测定，将结果记录在使用登记本上，并作为实验环境原始数据记录在实验报告上。
（６）消毒要求：无菌室每周和每次操作前用０．１％苯扎溴铵（新洁尔灭）或２％甲酚液或其他适宜消毒液擦拭操作台及可能污染的死角，方法是用无菌纱布浸渍消毒溶液清洁超净台的整个内表面、顶面及无菌室、人流和物流缓冲间的地板、传递窗、门把手。清洁消毒程序应从内向外，从高洁净区到低洁净区逐步向外退出洁净区域。然后开启无菌空气过滤器及紫外灯杀菌１～２ｈ，以杀灭存留微生物。在每次操作完毕，同样用上述消毒溶液擦拭工作台面，除去室内湿气，用紫外灯杀菌３０ｍｉｎ。
（７）其他要求：如遇停电，应立即停止实验，离开无菌室。关闭所有电闸。重新进入无菌室前至少开机运转１ｈ以上。
４?无菌室的维护
在消毒处理后、无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数，以此来判断无菌室是否达到规定的洁净度，常有沉降菌和浮游菌测定方法，还需定期进行洁净度再验证，定期更换新的紫外灯管、更换净化系统的初效、中效、高效头。洁净度不符合规定时立即停止使用，平时实验室内应尽可能减少人员的走动或活动，通向洁净室的门要关闭或安装自动闭门器使其保持关闭状态。非微生物室检验人员不得进入洁净室（无菌室），对必须进入的外来人员或维修人员要进行指导和监督。
二、超净工作台
超净工作台是一种局部层流装置，能在局部形成高洁度的工作环境。它由工作台、过滤器、风机、静压箱和支撑体等组成，采用过滤空气使工作台操作区达到净化除菌的目的（图1-２）。
内空气经预过滤器和高效过滤除尘后以垂直或水平层流状态通过工作台的操作区，由于空气没有涡流，任何一点灰尘或附着在灰尘上的杂菌都能被排除，不易向别处扩散和转移。因此，可使操作区保持无菌状态。
当前无菌室多在微生物制品工厂使用，一般实验室则使用超净台。与无菌室比较，使用净化工作台具有工作条件好、操作方便、无菌效果可靠，以及无消毒药剂对人体危害、占用面积小且可移动等优点。如果放在无菌室内使用，无菌效果更好。其缺点是价格昂贵，预过滤器和高效过滤器还需要定期清洗和更换。
三、生物安全柜
生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。
生物安全柜可以有效减少由于气溶胶暴露所造成的实验室感染以及培养物交叉污染，同时也能保护工作环境。
根据生物安全防护水平的差异，生物安全柜可分为一级、二级和三级３种类型。
一级生物安全柜可保护工作人员和环境而不保护样品，目前已较少使用。
二级生物安全柜是目前应用最为广泛，可提供工作人员、环境和产品的保护。
三级生物安全柜是为生物安全防护等级为四级的实验室而设计的，柜体完全气密，工作人员通过连接在柜体的手套进行操作，俗称手套箱，试验品通过双门的传递箱进出安全柜以确保不受污染，适用于高风险的生物试验（图１-３）。
注意：需要明确生物安全柜与超净工作台的区分。水平和垂直方向流出气流的工作柜（超净工作台）不属于生物安全柜，也不能应用于生物安全操作。超净工作台（超净台）是为了保护试验品或产品而设计的，通过吹过工作区域的垂直或水平层流空气防止试验品或产品受到工作区域外粉尘或细菌的污染。一旦微生物样品放置于工作区域，层流空气将把带有微生物介质的空气吹向前台工作人员而产生危险。
四、无菌操作
１?消毒与灭菌消毒与灭菌是微生物实验技术中最基本的操作，从事药品生产和检验的人员都应当了解消毒与灭菌的方法及其意义，严格遵守操作规程，否则会影响产品质量，危害患者安全。
（１）无菌：不存在活的生物。“无菌”从定义上来说是一个绝对的概念，在科学和技术高度发展的今天，药品或食品的绝对无菌既做不到，也无法加以证实。然而，无菌制剂的安全性要求人们设定无菌的相对标准。
（２）灭菌：使达到无菌状态的方法，用物理或化学方法杀灭传播媒介上所有的微生物，使其达到无菌。通常是指杀灭或除去全部活的微生物（包括繁殖体和芽胞）。
（３）消毒：用物理或化学方法杀灭或清除传播媒介上的病原微生物，使其达到无害化。通常是指杀死病原微生物的繁殖体，但不能破坏其芽胞。所以消毒是不彻底的，不能代替灭菌。
（４）无菌操作：防止微生物进入人体或者物体的操作方法，称为无菌操作或无菌技术。食品微生物的检验操作必须在无菌环境中用无菌操作进行。
２?常用的消毒方法实验室中常用的消毒剂如表１-１所示。
３?常用的灭菌方法微生物检测用的玻璃器皿、金属用具，以及培养基等必须经灭菌后方能使用。
（１）干热灭菌法：常见的有火焰、烧灼、干烤和红外线灭菌等。
１）火焰、烧灼：通常用于实验室无菌操作中金属或其他耐火材料制成的器具的灭菌。
２）干烤和红外线：利用干热空气或热辐射进行灭菌。一般１３５～１４５℃需３～５ｈ；１６０～１７０℃需２ｈ以上；１７０～１８０℃需１ｈ以上；１８０～２０℃需０．５～１ｈ。空气传热慢，穿透力不强，故干热灭菌时间长。干热灭菌时干燥箱内装入物品应留有空隙，以利空气流动，否则使箱内温度不均，部分物品灭菌不彻底。
（２）湿热灭菌法：通过热蒸汽或沸水使蛋白质变性而杀灭微生物的方法，湿热穿透力强，灭菌效果较干热好。
１）煮沸或流通蒸汽灭菌：常压下沸水和蒸汽的温度是１００℃，一般处理３０～６０ｍｉｎ可杀死细菌繁殖体，但不能完全杀灭芽胞。此法适用于不能高压蒸汽灭菌的物品。
２）巴斯德消毒法：某些物质在高温下易被破坏，巴斯德提出把液体物质在较低的温度下消毒，这样既可以杀死液体中致病菌的繁殖体，又不破坏液体物质中原有的营养成分。牛奶或酒类常用此法灭菌。典型的温度组合有两种：一种是６１．１～６２．８℃３０ｍｉｎ，另一种是７２℃１５～３０ｓ，现多用后一种。
３）间歇灭菌方法：灭菌方法系利用不加压力的蒸汽灭菌，某些物质经高压蒸汽灭菌容易破坏，可用此法灭菌。将欲灭菌物品置于锅内，盖上顶盖，打开排水口，使器内余水排尽。关闭排水口，打开进气门，根据需要消毒１０～２０ｍｉｎ。灭菌完毕关闭进气门，取出物品待冷至室温，放入３７℃温箱过夜，次日仍按上述方法消毒，如此３次，即可达到灭菌目的。
４）高压蒸汽灭菌：超过１个大气压时，水的沸点高于１００℃。高压蒸汽灭菌就是通过加压提高蒸汽温度，灭菌效果最好。此法简便、经济、可靠、无毒，是最可靠、应用最广泛的灭菌法。此法适用于耐高温和潮湿的物品。常用条件为：１１５．５℃３０ｍｉｎ；１２１．５℃２０ｍｉｎ；１２６．５℃１５ｍｉｎ。
注意：①必须完全排出灭菌器内的空气，否则会影响灭菌器内温度达到规定的要求。②被灭菌物品的温度。灭菌器内温度与被灭菌物品的温度一般是一致的，但在蒸汽输入过快时，后者可能低于前者，所以升温时要有一定的预热时间。另外，降温过快易引起玻璃炸裂。因此，对于一种灭菌产品，应制定一固定的灭菌曲线。③定期检查灭菌器内温度的准确性。
（３）化学灭菌法：利用化学试剂形成的气体来杀灭微生物的方法。常用的灭菌剂为环氧乙烷（又称氧化乙烯）。环氧乙烷是广谱杀菌剂，能杀灭细菌、芽胞和多种病毒，还能杀死昆虫及虫卵。但由于环氧乙烷易燃、易爆且有毒（有致变异性），用于药品方面极有限，多用于医疗器械、塑料制品等灭菌（不能用于橡胶和乳胶手套，能将其溶解）。
（４）过滤除菌法：利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理，除去对热不稳定的药品溶液或液体物质中的细菌的方法。过滤法一般只能除菌，不能除去支原体和病毒。过滤除菌的效果与滤膜的性能、孔径的大小、孔的密度、滤膜的厚度等因素有关。
（５）辐射灭菌法：辐射有两种类型：一种是电磁波辐射，如紫外线、红外线、微波；一种是电离辐射，如可引起被照射物电离的Ｘ线、γ线。紫外线的穿透力很弱，不能穿透一般包装材料，如玻璃、塑料薄膜、纸等，它主要用于空气和物体表面消毒。紫外线对眼、皮肤有损伤，工作人员应注意防护。γ线对人体细胞同样有害，６０Ｃｏ辐射灭菌用于食品和药品都应经过安全试验，进行科学的、全面的评价，使用高剂量辐射进行药品灭菌更应慎重。
４?微生物的接种和培养
（１）接种工具和方法：在实验室用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用涂布棒
（２）常用的接种方法有以下几种：
１）划线接种：是最常用的接种方法，即在固体培养基表面作来回直线形的移动就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环、接种针等。在斜面接种和平板划线分离中就常用此法。
２）三点接种：在研究霉菌形态时常用。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。
３）穿刺接种：在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针，培养基一般是半固体培养基。做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。
４）浇混接种：该法是将待接种的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至４５℃左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。
５）涂布接种：与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。
６）液体接种：从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液移至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。
７）注射接种：是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其他动物的体内，常见的疫苗预防接种就是注射接种。
８）活体接种：是专门用于培养病毒或其他病原微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式是注射，也可以是拌料喂养。
（３）常用的分离纯化方法：含有一种以上的微生物培养物称为混合培养物。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。
１）倾注平板法（图１-５ａ）：首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在４０～５０℃左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒温箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。
２）涂布平板法（图１-５ｂ）：首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。
３）平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等（图１-６）。当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。
４）富集培养法：富集培养法的方法和原理非常简单。可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。所创造的条件包括选择最适的碳源、能源、温度、光、ｐＨ、渗透压和氢受体等。在相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落。如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。
５）厌氧法：在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。然后快速冷却，并进行接种。接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。另一种方法是，在接种后，利用Ｎ２或ＣＯ２取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。有时为了更有效地分离某些厌氧菌，可以把所分离的样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。
５?无菌操作
（１）斜面接种时的无菌操作：
１）接种环前端部分烧红灭菌：如图１-７ａ所示。
２）试管前端过火：如图１-７ｂ所示。
３）打开试管塞：如图１-７ｃ所示。
４）试管倾斜，放入接种环，接种：如图１-７ｄ、ｅ所示。
５）试管前端过火，盖上试管塞：如图１-７ｆ、ｇ所示。
６）接种环烧红灭菌：如图１-７ｈ所示。
（２）自培养基上取单一菌落：
方法一：盖子微开遮住培养基，避免空气中菌体落入（图１-８ａ）。
方法二：培养皿反面拿起（图１ ８ｂ）。
（３）移取液体：
１）使用移液枪移取液体过程：如图１-９所示。
注意：在移液过程中防止倒置移液枪。
２）使用移液管移取液体过程：如图１-１０所示。
１?吸溶液：右手握住移液管，左手揿洗耳球多次；
２?把溶液吸到管颈标线以上，不时放松示指，使管内液面慢慢下降；
３?把液面调节到标线；
４?放出溶液：移液管下端紧贴锥形瓶内壁，放开示指，溶液沿瓶壁自由流出；
５?残留在移液管尖的最后一滴溶液，一般不要吹掉（如果管上有“吹”字，就要吹掉）
６?无菌操作要求食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念。许多试验要求在无菌条件下进行，主要原因：一是防止试验操作中人为污染样品；二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。
（１）接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。
（２）接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。
（３）接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用７５％乙醇棉球将手擦干净。
（４）进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用９５％乙醇点燃烧灼３次后使用。
（５）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。
（６）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。
（７）接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸５ｍｉｎ，再经火焰烧灼。
（８）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。
【关键词】无菌 实验室
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无菌操作接种技术
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2013年高中生物同步训练112 无菌操作和接种技术及微生物的分离
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3秒自动关闭窗口(8分)【生物技术实践】下表是一种培养基的配方，请回答：牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂水0.5g1g0.5g2g200ml(1)培养基从物理性质来说，属于培养基。(2)无菌操作是微生物培养最基本的要求，其中灭菌指的是____ 。对于培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌和消毒方法依次是____。（填代号）①化学消毒②灼烧灭菌③干热灭菌④紫外线灭菌⑤高压蒸汽灭菌⑥巴氏消毒法⑶在平板划线法中,每次在灼烧接种环后，为什么要等其冷却后再进行划线？ ____&&&&____(4)稀释涂布平板法统计菌落数目时，一般选择菌落数在____的平板进行计数，在某一稀释度下平板上的平均菌落数为50个，所用稀释液的体积为0.2ml，稀释倍数为105时，则每毫升样品中的菌落数为____。(5)以尿素为唯一氮源的培养基中加入____指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将____，利用这一特点，可准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。-乐乐题库
& 微生物的利用知识点 & “(8分)【生物技术实践】下表是一种培养基...”习题详情
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(8分)【生物技术实践】下表是一种培养基的配方，请回答：牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂水0.5g1g0.5g2g200ml(1)培养基从物理性质来说，属于&&&&&&&&&&&&&&&培养基。(2)无菌操作是微生物培养最基本的要求，其中灭菌指的是&&&&& 。对于培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌和消毒方法依次是&&&&&&&。（填代号）①化学消毒&②灼烧灭菌&③干热灭菌&④紫外线灭菌&⑤高压蒸汽灭菌&⑥巴氏消毒法⑶在平板划线法中,每次在灼烧接种环后，为什么要等其冷却后再进行划线？ &&&&&&&&&&&&(4)稀释涂布平板法统计菌落数目时，一般选择菌落数在&&&&的平板进行计数，在某一稀释度下平板上的平均菌落数为50个，所用稀释液的体积为0.2ml，稀释倍数为105时，则每毫升样品中的菌落数为&&&&&&。(5)以尿素为唯一氮源的培养基中加入&&&&指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将&&&&，利用这一特点，可准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。Array
本题难度：一般
题型：解答题&|&来源：2011-安徽省芜湖一中高三第二次模拟考试生物试题
分析与解答
习题“(8分)【生物技术实践】下表是一种培养基的配方，请回答：牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂水0.5g1g0.5g2g200ml(1)培养基从物理性质来说，属于培养基。(2)无菌操作是微生物培养最基本的要求，其中灭菌指的是...”的分析与解答如下所示：
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与“(8分)【生物技术实践】下表是一种培养基的配方，请回答：牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂水0.5g1g0.5g2g200ml(1)培养基从物理性质来说，属于培养基。(2)无菌操作是微生物培养最基本的要求，其中灭菌指的是...”相似的题目：
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欢迎来到乐乐题库，查看习题“(8分)【生物技术实践】下表是一种培养基的配方，请回答：牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂水0.5g1g0.5g2g200ml(1)培养基从物理性质来说，属于培养基。(2)无菌操作是微生物培养最基本的要求，其中灭菌指的是____ 。对于培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌和消毒方法依次是____。（填代号）①化学消毒②灼烧灭菌③干热灭菌④紫外线灭菌⑤高压蒸汽灭菌⑥巴氏消毒法⑶在平板划线法中,每次在灼烧接种环后，为什么要等其冷却后再进行划线？ ____&&&&____(4)稀释涂布平板法统计菌落数目时，一般选择菌落数在____的平板进行计数，在某一稀释度下平板上的平均菌落数为50个，所用稀释液的体积为0.2ml，稀释倍数为105时，则每毫升样品中的菌落数为____。(5)以尿素为唯一氮源的培养基中加入____指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将____，利用这一特点，可准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。”的答案、考点梳理，并查找与习题“(8分)【生物技术实践】下表是一种培养基的配方，请回答：牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂水0.5g1g0.5g2g200ml(1)培养基从物理性质来说，属于培养基。(2)无菌操作是微生物培养最基本的要求，其中灭菌指的是____ 。对于培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌和消毒方法依次是____。（填代号）①化学消毒②灼烧灭菌③干热灭菌④紫外线灭菌⑤高压蒸汽灭菌⑥巴氏消毒法⑶在平板划线法中,每次在灼烧接种环后，为什么要等其冷却后再进行划线？ ____&&&&____(4)稀释涂布平板法统计菌落数目时，一般选择菌落数在____的平板进行计数，在某一稀释度下平板上的平均菌落数为50个，所用稀释液的体积为0.2ml，稀释倍数为105时，则每毫升样品中的菌落数为____。(5)以尿素为唯一氮源的培养基中加入____指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将____，利用这一特点，可准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。”相似的习题。