荧光定量PCR
义项指多义词的不同概念，如的义项：网球运动员、歌手等；的义项：冯小刚执导电影、江苏卫视交友节目等。
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荧光定量PCR是( realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。
( realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被基团吸收;刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;时，Taq酶的5'端-3'端活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
TL988型仪应用领域临床疾病诊断:各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价;地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测;肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断;遗传基因检测实现遗传病诊断。动物疾病检测:禽流感、、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、炭疽芽孢杆菌。食品安全:食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。:医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。应用行业:各级各类医疗机构、大学及研究所、、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。
实时荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。随着生物芯片技术和荧光探针定量技术的结合，荧光定量PCR在医学检测及其他各个领域中的应用前景将更加广阔，令人欣喜。尽管如此我们也应清晰认识到，FQ-PCR技术在我国各个研究领域的应用并不多见，这就需要我国学者迎头赶上，使FQ-PCR技术更充分地推广，以推动研究工作的快速发展。
荧光定量PCR 实验步骤:
样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
RNA质量检测
1)紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。① 浓度测定A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下:RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为:35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。2)变性琼脂糖凝胶电泳测定①制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。10×MOPS电泳缓冲液浓度 成分0.4M MOPS，pH 7.00.1M 乙酸钠0.01M EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。②准备RNA样品取3μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。③电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。④紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型)，上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。
样品cDNA合成
①反应体系序号反应物剂量1逆转录buffer2μl2上游引物0.2μl3下游引物0.2μl4dNTP0.1μl5逆转录酶MMLV0.5μl6DEPC水5μl7RNA模版2μl8总体积10μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。②混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。
管家基因(β-actin)实时定量PCR①β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为10，反应前取3μl按10倍稀释(加水27μl并充分混匀)为10，依次稀释至10、10、10、10、10、10，以备用。②反应体系如下:标准品反应体系序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料10μl2阳性模板上游引物F0.5μl3阳性模板下游引物R0.5μl4dNTP0.5μl5Taq酶1μl6阳性模板DNA5μl7ddH2O32.5μl8总体积50μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。管家基因反应体系:序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料10μl2内参照上游引物F0.5μl3内参照下游引物R0.5μl4dNTP0.5μl5Taq酶1μl6待测样品cDNA5μl7ddH2O32.5μl8总体积50μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为:93℃2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。
①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。反应体系:序号反应物剂量110×PCR缓冲液2.5 ul2MgCl2溶液1.5 ul3上游引物F0.5 ul4下游引物R0.5 ul5dNTP混合液3 ul6Taq聚合酶1 ul7cDNA1 ul8加水至总体积为25ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。35个PCR循环(94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟); 72℃延伸5分钟。②PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×10，依次稀释至10、10、10、10、10、10几个浓度梯度。
①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。体系配置如下:序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料10 ul2上游引物1ul3下游引物1ul4dNTP1ul5Taq聚合酶2ul6待测样品cDNA5ul7ddH2O30ul8总体积50 ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为:93℃2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。
引物设计软件:Primer Premier 5.0，并遵循以下原则:引物与模板的序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
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SYBR Green 荧光定量PCR Mix[详细参数]
库存数量: 10000
产品规格: 200次
产品包装: 盒
产&&&&地: 北京
产品价格: 1 个
发货地点: 北京北京市
运费说明: 买家承担
SYBR Green 荧光定量PCR Mix[详细内容]
2 x SYBR Green qPCR MixSYBR Green 荧光定量PCR Mix
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目录编号 包装单位次次产品组成、储存、浓度：组成
1533022 x SYBR qPCR Mix 1.25 ml
1.25 ml x 4本制品本制品是采用SYBR? Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂。已经将热启动HotMaster Taq DNA聚合酶、dNTP、特殊稳定剂、优化的反应缓冲液、BSA和SYBR? Green I等试剂预混成一种适合Real Time PCR反应检测用2×Premix Type试剂，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点。使用时只需加入模板和引物和水，便可在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对目的基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。本品采用全新的Hotmaster Taq DNA 聚合酶，该酶不同于一般Hot-start 酶之处在于，一般的Hot-start 酶只在步温度升高之前封闭酶的活性，而Hotmaster Taq DNA 聚合酶是利用抑制剂通过温度调节方式封闭Hotmaster Taq DNA聚合酶的底物结合位点，温度低于40℃时，形成非活性的酶-抑制剂复合物，当温度升高至引物特异性的退火温度时，结合平衡向模板-特异性引物复合物形成方向移动，因此限度的减少PCR扩增全程中的非特异性扩增产物产生，大大提高了荧光定量PCR反应的性。TAKARA
SYBR Premix Ex TaqTAKARA
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SYBR Premix Ex Taq,ROX plus TAKARA
SYBR Premix Ex Taq II TAKARA
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供应商简介
北京博凌科为生物科技有限公司(Beijing BLKW Biotechnology Co., Ltd.) 创建于2009年,是一家专业从事分子生物学、细胞生物学、免疫学产品的研发、生产与销售，提供实验技术服务的国家高新技术企业。公司位于中关村科技园核心区域，周边环绕北大清华农大中科院等著名高等学府科研机构以及昌平生命科学园等生物产业集群。公司拥有全球领先的技术资源和经验丰富的管理团队,坚持以技术创新为先导，以产品质量为保障，以客户关怀为根本，在激烈的市场竞争中快速发展，销售网络遍布国内外。产品线主要包括核酸提取试剂盒、PCR、RT- PCR、荧光定量PCR、克隆与转化、DNA Marker、常
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标题: 荧光定量PCR引物设计原则(引物设计,荧光定量,引物,染料)
摘要: [荧光定量PCR引物设计原则(引物设计,荧光定量,引物,染料)] 我现在要用sybr染料做荧光定量PCR，说引物一定要设计好，想请教一下引物设计与普通PCR设计有什么不同，引物的长度，产物的长度都有什么要求？谢谢！ 关键词:[引物设计 荧光定量 引物 染料]……
我现在要用sybr染料做荧光定量PCR，说引物一定要设计好，想请教一下引物设计与普通PCR设计有什么不同，引物的长度，产物的长度都有什么要求？谢谢！
回复引物的具体设计要求：
1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件 看看结果。　2. 产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）。　3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。　4.G+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。　5.碱基要随机分布，尽量均匀。　6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。　7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。　8.引物5′端可以修饰。　9.3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。　10. 引物3′端要避开密码子的第3位。
11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。
可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。
12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.
13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。
14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源。 15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。
16.TM值在58-62度之间。
17.引物设计的软件Primer 5.0 有专门针对荧光的。
用染料做荧光定量不如探针特异性好，具体操作一下就知道了！
可以多定几对引物，免得摸条件浪费时间和金钱！很贵的啊！回复谢谢您，用探针大概花多少钱啊，我的课题费有限，帮忙给我一下建议回复多谢了，真及时，我也要做荧光定量pcr，希望做的过程可以多交流。回复我的引物是200多bp的，特异性不够好，可是长了设计的时候有发夹结构，应该怎么办好呢？回复我的引物是200多bp的，特异性不够好，可是长了设计的时候有发夹结构，应该怎么办好呢？
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特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。产地：国产|进口编号：YBP154规格：1ml/5×1ml品牌：百奥莱博产品介绍：YStart SYBR Green qPCR SuperMix-UDG是一种即用型实时定量PCR(qPCR) 的试剂，该试剂包含结合有特异性抗*(代&体&)的热启动 DNA聚合酶、SYBR GreenI荧光染料、dATP、dUTP、dGTP、dCTP、UDG(尿嘧啶DNA转葡糖基酶)以及PCR增强剂和稳定剂。SuperMix混合试剂的浓度为2×，使用时只需加入模板、引物及水，使其工作浓度为1×，即可进行荧光定量PCR反应。产品特点：o 使用结合有特异性抗*(代&体&)的热启动酶，增加了荧光定量PCR反应的特异性和灵敏性。o SuperMix中的UDG和dUTP可以阻止前次反应的残余PCR产物的重复扩增。dUTP确保扩增后的DNA中均含有尿嘧啶，而UDG可从单链或双链DNA上去除尿嘧啶残基，从而保证真正的目的序列得以扩增，有效防止PCR产物的交叉污染。o SYBR GreenI染料是一种直接与双链DNA结合的荧光染料。SuperMix中的SYBR GreenI染料荧光信号强，检测灵敏度高，可以检测出低至10拷贝的目的基因以及1 pg的模板DNA或RNA，适合溶解曲线分析。o 试剂组成中提供的ROX Reference Dye可以调整PCR加样误差所引起的管与管之间的差异。产品储存：-20°C避光保存一年。欲咨询购买YStart SYBR Green qPCR SuperMix-UDG价格，请致电北京百奥莱博科技有限公司，为您提供最全*(代&面&)周到的产品服务，除此之外，我公司正在促销以下产品：·蛋白磷酸酶抑制剂复合物 I (100×)编号：YBP120 规格：1ml/1ml×5 产品介绍：组织/细胞裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶，以各种方式催化磷酸化蛋白的去磷酸化，导致不同于正常生理状态的差异。因此，裂解后的Western blotting，免疫共沉淀检测磷酸化蛋白质、和蛋白激酶活性测定等实验常规要加入外源性蛋白磷酸酶抑制剂，抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，维持蛋白质的磷酸化状态。本抑制剂复合物以国际上主流配方改进而成，主要成份为多种独立的蛋白磷酸酶抑制剂，每种抑制剂可特异性抑制某种或几种蛋白磷酸酶活性。该复合物优化的组成使其可以强烈抑制几乎所有重要的蛋白磷酸酶活性，包括丝/苏氨酸磷酸酶、酪氨酸磷酸酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶以及ATP酶等。该复合物为100倍浓缩溶液，可直接加入任何组织类型和细胞的裂解产物中，均能有效抑制磷酸化蛋白质去磷酸化，从而维护蛋白质的磷酸化状态。产品特点：o 主要成份为多种独立的蛋白磷酸酶抑制剂。o 本产品为100倍浓缩水溶液，直接加入任何组织或细胞的裂解产物。o 可以强烈抑制几乎所有重要的蛋白磷酸酶活性，包括丝/苏氨酸磷酸酶，酪氨酸磷酸酶，碱性磷酸酶，酸性磷酸酶以及ATP酶等。适用范围：抑制丝/苏氨酸磷酸酶、酪氨酸磷酸酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶。适用于Western blot和免疫共沉淀检测磷酸化蛋白质、蛋白激酶活性测定等产品储存：-20°C保存，一年有效。YStart SYBR Green qPCR SuperMix-UDG价格关键词：YStart SYBR Green qPCR SuperMix-UDG,YBP154,百奥莱博·PLANTaid 植物RNA助提剂编号：YBP060 规格：10ml 适用范围：适用于富含多糖、 多酚植物总RNA抽提。产品储存：室温运输， 4°C保存， 可保存6个月。产品介绍：植物助提剂PLANTaid是针对植物富含多糖多酚等物质， 在RNA提取时不易去除的特点设计的一种多糖多酚植物RNA提取的辅助剂。 它们可以和多糖多酚等杂质结合， 通过离心去除它和绝大多数常用的使用离序盐(ChaotropicSalts ) 如异硫*酸胍的RNA提取方法兼容。 使用方法简便， 只要在正常的RNA提取步骤中加一步的步骤即可。PLANTaid加入裂解液后研磨， 匀浆， PLANTaid和多糖多酚等杂质结合离心将PLANTaid、 多糖多酚和任何不溶解的杂质去除。取上清就可以继续后面的正常RNA提取步骤了。YStart SYBR Green qPCR SuperMix-UDG价格关键词：YStart SYBR Green qPCR SuperMix-UDG,YBP154,百奥莱博PY01-036 &抗坏血酸 &AR|BR &25克 &丁香酸 GSH 530-57-4D-缬氨酸甲酯盐酸盐 Citric acid DAB法显色***&BTN100201 海量PCR片段纯化*** Mega PCR Clean-Up KitFMOC-L-异亮氨酸 o-Phenanthroline hydrochloride L-缬氨酸甲酯盐酸盐 MEGA-10 ARB13195 小鼠脂肪型脂肪酸结合蛋白4(FABP4)Elisa方法检测 ARB10097 人EB病毒IgG(EBv IgG)尿液中含量检测 Human epstein-barr virus igg,ebv igG ELISA KITSJ0662 质粒小提*** Pepstatin A & 胃蛋白酶抑制剂ARB10752 人抑制素B(INHB)含量测试 BTN130614 Therminator DNA聚合酶 Therminator DNA PolymeraseL-天门冬氨酸钾 4-MU 北京百莱博科技有限公司专业生产供应销售生物试剂、化学试剂、抗原抗*(代&体&)、血*(代&清&)血浆、Elisa***，更多试剂产品需求，欢迎来电咨询选购。
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