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【求助】请各位老师帮忙分析一下激光共聚焦图片是否正常，致谢
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这个帖子发布于5年零122天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
本人近期对一段组织（厚约1mm）做了一次共聚焦，因以前没做组织方面的经验，不知此图片中的背景是否正常，个人感觉背景有点深，但又不确定。请有此方面经验的老师帮忙分析一下，万分感谢。具体操作如下：1.4%多聚甲醛固定了四天（因初次预定的观察日期推迟致使多固定了几天）。2.pbs-Tween洗5次x5min（所有清洗过程均在24孔板中进行， 每次用量为2ml）3.二抗同源血清、1%BSA 0.5%Triton RT封闭1h4.1%BSA 0.1%Triron PBS中 孵育一抗 湿盒 4度 过夜5.0.1%Triton PBS-Tween 洗5次x10min6.0.1%Triton TR标记的二抗 湿盒中 RT 1h 7.PBS-Tween 洗5次x10min8. 防焠灭剂封片 4度保存 第二天共聚焦观察一、二抗和防淬灭剂均来自scrus，浓度均为其推荐浓度。操作中戴手套、口罩，载玻片、盖玻片均泡过酸清洗。另外，原本准备了三个标本，因第一次做没有经验，电镜室的老师找了将近一个小时才初步摸索好各种参数，第一个标本就花了2小时。此段时间，另外两个标本一直放于旁边备用，但当观察完第一个、再看第二个标本时，相同参数下却找不到任何荧光点，刚开始以为标本没做好，但换用第三个标本同样未发现任何荧光。当时我看到房间温度计显示20摄氏度，怀疑是温度所致，将标本置于冰箱中冷却后再次观察后果然成功观察到了目标物，但强度却明显低于第一个标本。镜下观察前所有标本一直避光，现在看来温度对荧光还是有一定影响的。所以想通过自身的教训提醒各位同道以后做共聚焦时别出现类似“事故”.....好了，小弟在此期待着各位前辈对此图的评价。如果确是背景过深的话，请各位前辈提些建议。小弟在此谢过各位啦
不知道邀请谁？试试他们
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这是组织不同层面的图片：
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你用的什么染色？怎么感觉这么模糊呢？还有你要染的东西和细胞怎么是同一种颜色的荧光？
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不成功的实验。
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FFGGQQ 你用的什么染色？怎么感觉这么模糊呢？还有你要染的东西和细胞怎么是同一种颜色的荧光？首先，十分感谢您的关注。1.一抗是羊抗鼠，二抗是牛抗羊-TR.激发波长543nm（不知是否还有更佳的激发波长？）。2.我们的实验是以某固定间隔对组织进行连续切片扫描，所以对于同一物体而言，每一层的图像荧光强度也将逐渐变化（由强到弱或由弱到强）。我们的目的是只对目标物定量分析。3.我理解您的疑问。细胞被部分染色在我们意料之中，因为我们要观察的目标物与此细胞具有部分同源性，只是没想到细胞的荧光也这么强而且周围背景不知为何也不理想........（而对于目标物的标记目前市面上只有一种抗体，也就是实验中用的这种，所以更换抗体似乎不太现实，如果DAPI对细胞核进行复染情况会不会有所改善？如果可以用DAPI的话，以后观察时需要用双通道吗？）。4.分析图片时我也在想细胞的荧光色有可能会影响我们对目标物的计数，却苦于没经验不知该如何是好，所以才来求助各位前辈...期盼您的回复。这是众多图片（众多层）中的另一张：期盼您的回复。
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tree1004 不成功的实验。前辈您所说的“不成功”是指目标物未能与其他物质在荧光颜色上区分开来吗？还是另有所指？如果是前者的话，我现在苦恼的是：我们的目标物与图中的细胞具有部分同源性，标记此目标物的抗体目前却只有这一种。所以恳请前辈赐点经验以解燃眉之急....
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tree1004 不成功的实验。请问大侠 我从细胞上清液中提取到的100nm左右的囊泡结构（exosome）能否用荧光标记抗体结合到囊泡表面的蛋白后 再用激光共聚焦显微镜观察呀
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追寻希冀 首先，十分感谢您的关注。1.一抗是羊抗鼠，二抗是牛抗羊-TR.激发波长543nm（不知是否还有更佳的激发波长？）。2.我们的实验是以某固定间隔对组织进行连续切片扫描，所以对于同一物体而言，每一层的图像荧光强度也将逐渐变化（由强到弱或由弱到强）。我们的目的是只对目标物定量分析。3.我理解您的疑问。细胞被部分染色在我们意料之中，因为我们要观察的目标物与此细胞具有部分同源性，只是没想到细胞的荧光也这么强而且周围背景不知为何也不理想........（而对于目标物的标记目前市面上只有一种抗体，也就是实验中用的这种，所以更换抗体似乎不太现实，如果DAPI对细胞核进行复染情况会不会有所改善？如果可以用DAPI的话，以后观察时需要用双通道吗？）。4.分析图片时我也在想细胞的荧光色有可能会影响我们对目标物的计数，却苦于没经验不知该如何是好，所以才来求助各位前辈...期盼您的回复。这是众多图片（众多层）中的另一张：期盼您的回复。嗯，看来你的问题第一是抗体特异性不好，背景值太高，一个办法是看看有没有 block-Ab，先把细胞表面那些乱七八糟的抗原屏蔽掉。另外，还可以用PKH 给细胞膜染色，有种PKH是红色的，忘记是PKH35还是67了，这是种lipid dye，有这个，你可以很清晰的标记出细胞膜的范围，而且这东西很亮。在confocol下你可以把那个绿色荧光调的弱一些，只留下你需要的标记物，然后把图片和PKH染色的细胞重叠。如果你运气好，就能得到一个很漂亮的红配绿的艺术品了。至于DAPI，嗯，有PKH了你还需要DAPI吗？如果你还想再玩的high一些，还可以3D重建，弄个细胞的3D影像，可以清晰的显示出来你标记的东西在细胞上的具体位置...OK ...SCI paper不是梦对了，还补充一句，虽然可能性不大，但你没加羊抗鼠抗体的阴性对照显微镜下是不是也有这么强的绿色荧光？
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zhang_nana 请问大侠 我从细胞上清液中提取到的100nm左右的囊泡结构（exosome）能否用荧光标记抗体结合到囊泡表面的蛋白后 再用激光共聚焦显微镜观察呀首先声明：我不是卖PKH的，但我真的很喜欢用这东西染带膜结构的东西。挂了荧光的抗体当然也是一个不错的选择，但这个你要选择细胞表面高表达的抗原特异抗体。否则，confocol拍出来的影像就不是一个连续的环，而是一个一个分散的点
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非常感谢FFGGQQ的建议，我提取的就是膜囊性的小泡，悬浮于PBS中，有脂质双层结构，表面高表达MHC-I /II分子。能否用荧光二抗标记？大概的标记方法呢 ？是否加入一定量的抗体孵育就可以了啊？
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非常感谢FFGGQQ的建议，我提取的就是膜囊性的小泡，悬浮于PBS中，有脂质双层结构，表面高表达MHC-I /II分子。能否用荧光二抗标记？大概的标记方法呢 ？是否加入一定量的抗体孵育就可以了啊？=====我没用过抗MHC抗体，如果你有合适的特意性抗体的话，就拿来染吧，一抗结合MHC分子，2抗上荧光。另外，还建议你，最好往PBS里加点胎牛血清（图便宜就用新生牛血清）1% 即可双抗染色好处是信号比较强，但问题也存在背景会强一些。如果背景太高，你可以看看只用荧光标记的抗MHC 抗体。再不行的话...嗯，你周围有人用PKH吗？
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FFGGQQ 嗯，看来你的问题第一是抗体特异性不好，背景值太高，一个办法是看看有没有 block-Ab，先把细胞表面那些乱七八糟的抗原屏蔽掉。另外，还可以用PKH 给细胞膜染色，有种PKH是红色的，忘记是PKH35还是67了，这是种lipid dye，有这个，你可以很清晰的标记出细胞膜的范围，而且这东西很亮。在confocol下你可以把那个绿色荧光调的弱一些，只留下你需要的标记物，然后把图片和PKH染色的细胞重叠。如果你运气好，就能得到一个很漂亮的红配绿的艺术品了。至于DAPI，嗯，有PKH了你还需要DAPI吗？如果你还想再玩的high一些，还可以3D重建，弄个细胞的3D影像，可以清晰的显示出来你标记的东西在细胞上的具体位置...OK ...SCI paper不是梦对了，还补充一句，虽然可能性不大，但你没加羊抗鼠抗体的阴性对照显微镜下是不是也有这么强的绿色荧光？感谢前辈的热心解答。1.在您这儿首次学到了用Ab封闭嘿嘿，只是目前还未查到相关的文献......上次的封闭血清是10%胎牛，下次打算增加到30%试试2.另外，您所说的PKH价格大约多少？容易买到吗？3.关于3D重建，我还想问一下前辈：3D重建是不是把扫描出的所有图像集合后得出的3维图？要完成此过程的话，技术人员的操作复杂吗？我一个标本大约扫描出300张图片，大约再需要多长时间可完成3D重建？4.本来第一次实验的3个标本中有一个是阴性对照，但因意外最终没能观察成，打算下周再做一次，到时候再看看结果如何，会把结果反馈上来。再次期待您的解答，先谢啦。
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Triton X-100用的浓度太高，时间太长，温度太高，次数太多。组织有点厚细胞形态也不该是这样的
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追寻希冀 感谢前辈的热心解答。1.在您这儿首次学到了用Ab封闭嘿嘿，只是目前还未查到相关的文献......上次的封闭血清是10%胎牛，下次打算增加到30%试试2.另外，您所说的PKH价格大约多少？容易买到吗？3.关于3D重建，我还想问一下前辈：3D重建是不是把扫描出的所有图像集合后得出的3维图？要完成此过程的话，技术人员的操作复杂吗？我一个标本大约扫描出300张图片，大约再需要多长时间可完成3D重建？4.本来第一次实验的3个标本中有一个是阴性对照，但因意外最终没能观察成，打算下周再做一次，到时候再看看结果如何，会把结果反馈上来。再次期待您的解答，先谢啦。1. 关于PKH，可以看看这个，sigma 公司的2. Confocol 3D 重建，大体上类似CT或MRI 层扫然后3D 重建吧，你在软件里设定层扫的起始点和结束点，还有一个层扫的间距，然后开扫，中间看你设定的层扫间距范围，时间上大概几分钟到若干分钟....（没事干你可以去下个电影喝杯茶）系统层扫重建完成后，会自动生成一个3D 模型，如果你的细胞染色和荧光聚焦什么的都设置的很漂亮的话，理论上你就会得到一个上面带了各种标记物的大泡。3. 至于用block-Ab，我不了解你用的是什么组织，标记什么，具体是什么导致的背景荧光。所以，具体这招怎么用，建议你还是要多了解你研究的这个组织细胞入手，细胞膜上都有什么，抗原相似性多高等等
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paroxysm Triton X-100用的浓度太高，时间太长，温度太高，次数太多。组织有点厚细胞形态也不该是这样的谢谢前辈的评价。下次我会适当降低Triton的浓度，缩短抗体反应的时间。我想请教一下前辈：1.封闭时，Triton的浓度是不是越高越好（例如0.5%）？2.您认为“次数太多”，意思是一抗和二抗孵育时不需要用Triton？我们实验中待检测的目标物质位于细胞内，如果不用Triton的话会不会影响目标物质与抗体的结合？3.您所说的“温度太高”是指哪一步骤中的温度高？4.因为我们扫描的是组织块，其中含有众多不同类型的细胞，目标物质附近的细胞种类较多。如果仅从大小上来说，第一张图中的“细胞”更像是细胞核，但到底是细胞核还是处于不同层面的其他不同类型的细胞还有待证实，我们打算下次时使用DAPI复染，看看效果。再次感谢您的关注，期待您的解答。
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FFGGQQ 1. 关于PKH，可以看看这个，sigma 公司的2. Confocol 3D 重建，大体上类似CT或MRI 层扫然后3D 重建吧，你在软件里设定层扫的起始点和结束点，还有一个层扫的间距，然后开扫，中间看你设定的层扫间距范围，时间上大概几分钟到若干分钟....（没事干你可以去下个电影喝杯茶）系统层扫重建完成后，会自动生成一个3D 模型，如果你的细胞染色和荧光聚焦什么的都设置的很漂亮的话，理论上你就会得到一个上面带了各种标记物的大泡。3. 至于用block-Ab，我不了解你用的是什么组织，标记什么，具体是什么导致的背景荧光。所以，具体这招怎么用，建议你还是要多了解你研究的这个组织细胞入手，细胞膜上都有什么，抗原相似性多高等等感谢前辈的无私帮助，确实收获颇丰。PKH26我问过了，7700 CNY，不便宜呵呵。我们这里有现成的DAPI，所以打算先用一下看看效果怎样，没准还会有什么意外发现谁知道呢嘿嘿考虑到初次实验中的细胞（更可能是细胞核）也发出绿色荧光，我现在倾向于认为与一抗的非特异性结合较多有很大关系，但也不排除组织中自发荧光的可能。打算下次在一抗孵育前，先用DAPI染核，不知道这样会不会消耗些非特异抗原的位点。另外再做一个阴性对照......关于DAPI的使用，不知还能不能分享点您的宝贵经验？嘿嘿
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追寻希冀 感谢前辈的无私帮助，确实收获颇丰。PKH26我问过了，7700 CNY，不便宜呵呵。我们这里有现成的DAPI，所以打算先用一下看看效果怎样，没准还会有什么意外发现谁知道呢嘿嘿考虑到初次实验中的细胞（更可能是细胞核）也发出绿色荧光，我现在倾向于认为与一抗的非特异性结合较多有很大关系，但也不排除组织中自发荧光的可能。打算下次在一抗孵育前，先用DAPI染核，不知道这样会不会消耗些非特异抗原的位点。另外再做一个阴性对照......关于DAPI的使用，不知还能不能分享点您的宝贵经验？嘿嘿PKH国内卖那么贵吗？ 抢
劫啊！袋鼠国才300多刀DAPI，我都是最后封片的时候染的，几乎加进去就染了，很快，染完了也不用洗（片子都封了还洗啥.....) 。你如果没有含DAPI的封片液，也可以考虑最后再染
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时隔半年，实验及文章终于搞定，终于有时间回来向各位曾热心帮助过的前辈补谢，试验期间曾试过各种不同的抗体浓度、孵育时间、漂洗液中Triton的浓度也尽量做到最小，有时甚至未用，从总的结果看来，背景深应该与一抗抗体的浓度关系最大，其次与共聚焦激光的激光波长有关，尽管试过多种方案，调过多种波长，但仍未能得到令自己满意的图片，现从背景较低的一个标本图片中选取一张，tif貌似传不上来，只好截图如下：尽管仍有部分背景，但处理过后效果还算可以接受。飞秒激光双通道时，背景往往会增多，另外两个标本其中某层的图片分别如下（仍为截图）：经处理后效果勉强接受，但3D重建后效果不算清晰，论文中未用上，很遗憾。现在回想起此前的实验之路，感觉经验真的很重要，第一次接触共聚焦和免疫荧光，其中有很多环节都要小心翼翼，加上自己的标本微小、取材艰难，抗体标记时真的有种步履薄冰的感觉，暗室里操作（尤其是漂洗时）光找标本有时就得找半天，看得眼都花了.....后续的铺片也颇费时间...当付出许多最终得到这些来之不易的图片的时候（尽管没想象中那么漂亮），心中的那种舒畅感觉也许只有自己亲身经历过的人才能体会.今天投出了自己今生的第一篇SCI，也是自己的第一篇论文，希望自己此前的付出能有美好的回报......，再次向曾提出过宝贵意见和建议、曾给予过热心帮助的各位前辈致敬，谢谢你们！
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恭喜，以后你会越做越好的
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FFGGQQ 恭喜，以后你会越做越好的谢谢前辈您的鼓励，也祝您事事顺心，嘿嘿
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我跟男友是相亲的，已订婚。订婚太早，跟对方没什么了解，现在后悔中。
当初订婚是男方摧的，看男方还勤快，就订了。后来接触中男方家极其抠门，男方家来我家N趟都是空手，什么东西都没带过，我去他家都带东西，表示礼貌下。一开始我以为是男方不拘小节，后来发现是不想花钱，并不是在乎男方家有没有带东西过来，只是感觉一个态度问题。
每次跟男方出去基本都是我花钱，出去逛一下基本花500到1000左右，男方最多出个车费，然而我对这些一开始没计较，无所谓，到后来发现是不想花钱
男方来我家有10趟，没有一次带东西的，我打亚面说过，人家没当一回事。初一，到初5都来我家，都没带东西，直到订婚来才带2瓶酒跟两条烟，订婚后在来也没带东西。从接触到现在有半年多了，只有订婚时带东西来，什么东西都没买过给我家
我多次提到带东西，并不是我在乎他家带什么，我只是要一个态度问题，交往半年，只有订婚给的订婚钱，平时一分钱也没有在我身上花过，基本都是我花钱，
端午节他妈过来，带来的水果都是烂的，当时我在上班，我要是在他妈面前，我都直接当他妈面给扔了，不想花钱就别花，送烂香蕉算什么事
第二次他妈来我家，我洗水果给他妈吃，他妈问有没有芭蕉，我说没有，乡下没有卖的，他妈说他家只吃芭蕉，我真呵呵了，你家只吃芭蕉，送我家烂香蕉
哦，对了，61送我礼物了，你们猜送的是什么，都想到吧，送我积木，对就是3岁孩子玩的积木，不知道积木的可以TB搜看看
我觉得还是分吧，感觉以后一起生活的话，矛盾会比较多，在花钱这方面～
我们现在有一个月没联系了，我主动给他发过信息，我想在忙，也不可能一个月都没时间，联系我，吃饭
睡觉都有时间，难道问候下就没时间？
男方家2个孩子，他还有个弟，他家条件一般般，我去他家一次都看出，他妈偏心他弟，每次去他家，他妈寒着脸，跟我欠他钱似的
好奇葩啊 送积木 不知道送啥可以问度娘啊 也不用这么白痴吧 你可想好了啊 结婚一辈子的事呢 跟这样的人一起生活你可做好心理准备 反正我接受不了
　还是分了吧，本来相亲的没什么感情基础。他现在都不舍得为你花钱更别说以后了，看他妈妈的态度也不像好相处的　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　对方拒绝回复你的帖子，并摸了下你的奶子，觉得手感不错，又揉了几下
这男的是傻逼么送积木……妹子虽然我不认识你，就算你只有6分，你也可以找个同6分的，真不用这么委屈自己的，即使你是大龄剩女，也不代表你就要这么将就，这男的也就2分吧，让他去找个同2分的女的去吧
昨晚我把他扣扣，微信都删了，我看他什么时候跟我联系
男人喜欢不喜欢你就看两点，一肯不肯为你花钱，二肯不肯为你花时间
妹子不分还等着他让你给他买iPhone7吗？
果断分 总比到时候结婚后离婚好
分吧，不分留着过年啊？看男方妈妈也不太会做人，如果结婚了，这样的婆婆会很难相处
感觉两个人都处的不开心，分了算了吧，反正也才认识半年，早分早好
假设是我。那么我会考虑分。他可以没有钱，家世背景什么都没有，但是首先得有爱。退一步来说，就算是相亲来的没有感情基础，但是起码得懂得尊重对方。不说为女友花多少钱，尽心尽力就好，能懂得为对方着想。送礼这个是外在的，主要看心意。即使是抠，或是节省，但男方应该承担起自己的责任。可能他自己不觉着什么？你如果还想再考虑一下，可以打个电话约他当面谈一下，指明问题。看他的反应，是当面答应事后慢慢改变呢就挺好看他诚意咯。如果是当面沉下去甩脸色，那就真的没有必要了。虽然关于年龄大，但真的不能太凑合。这种一步步积累最后爆发都是致命的问题。与其拖下去耽误自己还不如现在好好决断一下 。婆婆这个问题我想可能也主要在于儿子吧。嗯？就酱。胡言乱语，只供参考哦。顺便，其实我觉得61积木那个真的挺萌啊？不懂妹子为什么生气？好吧，么么。
姑且不说他家有没有钱
我觉得 如果他真的尊重你
就算没有钱也会买一点东西意思一下
无论贵不贵吧…如果我是你
我应该会分的
而且和他明确说清楚
不然到时候谁知道会不会以奇葩的理由找你麻烦
男方家在外面开小吃店的，家里就3套房子，他妈一套，他一套，他弟一套，长的一般，个子165，每次去他家，他妈寒着脸，跟我欠他钱似的，我家虽然是乡下的，但我父母不需要我养老，我有个弟，妈妈开超市，父亲跟亲戚在深圳开几个店，家里条件比男方好，我长得不丑，160，偏瘦将近90斤，开始说了如果男方对我好，可以不要彩礼，有房有车就行，女方会陪嫁将近20万。下面是我照片，冬天拍的，美了颜，没化妆，个人感觉我长得不丑，毕竟追我的人还有
蟹蟹大家的意见，我准备分手，会说清楚，订婚钱
订婚宴跟戒指会折成现金给他家，我才不稀罕你家那几个破钱
分，从你的描述里可以看到，嫁过去之后大概就是贴补他家贴补他弟伺候他老母给他们家生孩子，有什么矛盾神马滴你可打不过那一家三口
婚前就寒着脸，婚后还得了，好可怕的婆婆……我觉得楼主挺清纯的
订婚（包括结婚生孩子）男方催太急但是平时表现他对你根本又不上心的话，请调查对方是不是gay。
果断分,这也太他妈抠门
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