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【例1】男，85岁。因反复心悸、胸闷6年，再发1小时入院。近6年无诱因反复心悸、胸闷，劳累时加剧，无胸痛及晕厥，曾多次住我院，心电图检查示异位心律、心房颤动(房颤)，呈阵发性发作，经活血化淤、营养心肌等积极治疗，2～5天可恢复窦性心律。入院前1小时上述症状再发。查心电图示异位心律，房颤(心室率80/min)，收住院。既往有高血压病3年，慢性支气管炎、肺气肿10余年，对青霉素、中药红花过敏。查体：血压130/80mmHg。桶状胸，肺气肿征阳性，心率79/min，房颤心律，双踝周轻度凹陷性水肿，余无特殊体征。诊断：①冠心病、房颤、心功能Ⅱ级；②原发性高血压1级(极高危组)；③慢性支气管炎(缓解期)；④阻塞性肺气肿。查血钾4.1mmol/L，镁0.65mmol/L。常规予双丁酰环磷腺苷、复方丹参滴丸、比索乐尔及含镁能量合剂等药物降压、对症治疗，未复律。第2天心电监护示仍为房颤，心室率60～80/min。除以上治疗外，改含镁能量合剂为含镁极化液缓慢静脉滴注，另加用乳酸钠林格氏液补充电解质。当输注镁极化液时，患者诉心悸、胸闷，心率升至130～150/min，考虑极化液反应，改换乳酸钠林格氏液，口服地高辛0.25mg，心室率仍不降。追问患者及家属，病史中有氯化钾反应史。停乳酸钠林格氏液改用普通能量合剂(不含钾)，心室率渐下降，出现房性心律、心动过缓，最慢时仅37/min。心电图示：①异位心律(室上性)；②缓慢至房颤(心室率41～49bpm，最长R-R间期2.2秒，ST-T正常)。经积极营养心肌治疗3天，恢复窦性心律。心电图示窦性心律，不完全性右束传导阻滞，部分导联T波改变(心室率63/min)。住院治疗21天好转出院。此后患者出现病窦综合征，安装永久性心脏起搏器。
&&& 【例2】男，78岁。因反复心悸、胸闷10年，再发1个月，加重1小时入院。反复多次住我院，多次心电图及超声心动图检查明确诊断为冠心病、心律失常(阵发房颤、房性早搏)。病史中有原发性高血压、慢性支气管炎、肺气肿史，曾有输注氯化钾反应病史。此次在门诊因腹泻输液补钾，诱发心悸、胸闷加剧，发病1小时入院。心电监护示心室率最快达120～140/min，予比索乐尔、毛花苷C等扩冠、活血化淤治疗3小时，心室率渐减慢至40～50/min，房性异位心律伴较多室早，停比索乐尔，予对症治疗，第2天恢复窦性心律，住院治疗半个月好转出院。
& & 钾为细胞内主要阳离子，在细胞外液浓度较低，钾之所以能维持细胞内外梯度差，是因为细胞膜上的钠泵主动将钠泵出而使钾进入细胞，从而保持了细胞内比较高的钾浓度，有利维持细胞内外水、电解质平衡。钾通过与细胞外的氢交换，参与酸碱平衡的调节。钾还参与糖、蛋白质的合成及二磷酸腺苷转化为三磷酸腺苷的能量代谢，也参与神经冲动传导和神经末梢递质乙酰胆碱的合成，维持神经肌肉的正常兴奋性；另外，钾与其他阳离子相互协调，维持心肌的正常舒缩功能。血钾过高可抑制心肌的传导性、自律性和兴奋性。极化液可促进心肌摄取和代谢葡萄糖，使钾离子进入细胞内，恢复细胞膜的极化状态，以利心肌的正常收缩，减少心律失常，临床使用较为普遍。前述2例使用正常浓度极化液缓慢静脉滴注治疗心律失常反而出现心律失常加重，考虑系氯化钾反应，似高钾血症抑制心肌的传导性、自律性和兴奋性，加重心律失常，极为少见，应引起临床医师的注意。
& & 来源：廖俊龙.临床误诊误治，）：088.
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定量检测人乳腺癌特异性基因1 mRNA表达水平的试剂盒
来源：广搜网
公益为中国网民提供数字化信息
发布日期： 18:11:37
&&&&发明人：程民 胡世莲 魏海明 沈国栋陈永艳 徐维平 徐婷娟 王卫东（摘要：本发明公开了一种定量检测人乳腺癌特异性基因1 mRNA 表达水平的试剂盒。该试剂盒中含有由序列表序列1 所示的一条引物和序列表序列2 所示的另一条引物组成的特异性引物对，还含有核苷酸序列如序列表序列3 所示的特异性探针。本发明试剂盒可对人乳腺癌特异性基因BCSG1mRNA 的表达进行准确的定性及定量分析，检测特异性高，可达100%，比目前临床检验方法能更早地发现乳腺癌细胞的扩散；检测全血的灵敏度为100 拷贝/ml。本发明的试剂盒可实时监测乳腺癌患者骨髓及血中的BCSG1 mRNA 表达量，对判断乳腺癌的发生、转移、复发，治疗效果评价及病情的动态观察具有重要意义，应用前景广阔。）
1. 用于检测人乳腺癌特异性基因1mRNA 表达量的试剂盒，其特征在于：含有由序列表序列1 所示的一条引物和序列表序列2 所示的另一条引物组成的引物对。2. 根据权利要求1 所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有核苷酸序列如序列表序列3 所示的探针。3. 根据权利要求1 或2 所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有尿嘧啶DNA 糖基化酶。4. 根据权利要求1-3 中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有如下组成的PCR 反应缓冲液：由终浓度为17.9-19.5mmol/L 的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐、终浓度为2.55-2.90mmol/L 的氯化镁和终浓度为90.0-96.3mmol/L 的氯化钾组成，溶剂为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述PCR 反应缓冲液中的终浓度。5. 根据权利要求2-4 中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有如下组成的PCR 反应液：由所述PCR 反应缓冲液、DNA 聚合酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、权利要求1 中所述引物对、权利要求2 中所述探针和尿嘧啶DNA 糖基化酶组成，其余为水。6. 根据权利要求1-5 中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR 反应缓冲液在所述PCR 反应液中的浓度为0.9μl/μl ；所述DNA 聚合酶在所述PCR 反应液中的浓度为0.08-0.14U/μl ；所述dATP 在所述PCR 反应液中的浓度为370-420nmol/L ；所述dCTP 在所述PCR 反应液中的浓度为370-420nmol/L ；所述dGTP 在所述PCR 反应液中的浓度为370-420nmol/L ；所述dTTP 在所述PCR 反应液中的浓度为180-215nmol/L ；所述dUTP 在所述PCR 反应液中的浓度为370-420nmol/L ；每条所述引物在所述PCR 反应液中的浓度为0.28-0.42μmol/L ；所述探针在所述PCR 反应液中的浓度为0.17-0.25μmol/L ；所述尿嘧啶DNA 糖基化酶在所述PCR 反应液中的浓度为0.0U/μl。7. 根据权利要求1-6 中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有反转录缓冲液；所述反转录缓冲液由如下物质组成：终浓度为8.0-9.8μmol/L 的Oligo(dT)12-18、终浓度为3.15-4.0U/μl 的RNA 酶抑制剂、终浓度为70.0-76.0mmol/L 的二硫苏糖醇、终浓度为170-195mmol/L 的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐、终浓度为255-290mmol/L 的氯化钾、终浓度为9.25-12.5mmol/L 的氯化镁，其余为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述反转录缓冲液中的浓度。8. 根据权利要求1-7 中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有反转录反应液；所述反转录反应液由所述反转录缓冲液、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、逆转录酶组成；其余为水；所述反转录缓冲液在反转录反应液中的浓度为0.786μl/μl ；所述dATP 在反转录反应液中的浓度为1.30-1.60mmol/L ；所述dCTP 在反转录反应液中的浓度为1.30-1.60mmol/L ；所述dGTP 在反转录反应液中的浓度为1.30-1.60mmol/L ；所述dTTP 在反转录反应液中的浓度为1.30-1.60mmol/L ；所述逆转录酶在反转录反应液中的浓度为11.5-16.5U/μl。定量检测人乳腺癌特异性基因1 mRNA 表达水平的试剂盒技术领域[0001] 本发明涉及一种定量检测人乳腺癌特异性基因1mRNA 表达水平的试剂盒。背景技术[0002] 乳腺癌作为一种常见的恶性肿瘤，严重威胁女性的生命和健康。因地理环境、生活习惯等的不同，乳腺癌在世界各国的发病率有很大差异，北美和北欧的大多数国家为高发区，南美和南欧一些国家为中等，亚洲、拉丁美洲和非洲的大多数国家为低发区。在北美、两欧等发达国家，女性乳腺癌的发病率居女性恶性肿瘤发病率的首位。据美国癌症协会估计，美国每年有12 万乳腺癌新发病例，发病率为72.2/10 万。我国虽属世界上女性乳腺癌的低发区，但近年来乳腺癌的发病率明显增高。我国各地区乳腺癌的发病率也不相同，沪、京、津及沿海地区是我国乳腺癌的高发地区，2006 年我国乳腺癌发病率为52/10 万，居女性恶性肿瘤中的第一位。[0003] 乳腺癌的治疗方法有多种，如外科手术切除、放射治疗、化学治疗等。目前，手术切除为乳腺癌综合治疗方法中的首选，然而在手术切除技术已达到相当成熟和普及的同时，乳腺癌切除后的高复发和转移率已成为阻碍乳腺癌患者生存期提高的主要原因。手术前乳腺癌细胞由于自然或侵袭性医源性因素脱落至外周血并随血液转移至乳腺外，形成循环肿瘤细胞，但是由于受检测方法灵敏度及特异性较低的限制，该微量的癌细胞未能被检测到，这些癌细胞随血液到达外周组织并处于休眠状态，当患者机体免疫功能下降时，如大手术或移植后应用抗排斥免疫抑制剂等，休眠的癌细胞就有可能被激活，随血液循环返回到乳腺，并在乳腺内恢复增殖，从而导致了乳腺癌的复发。肿瘤的转移是临床治疗的一大难题，也是肿瘤致死的一个重要原因。目前，肿瘤转移的发现和确定，主要根据影像学（X 线、CT、磁共振、PET 等）或病理形态来诊断。影像学检查中，病灶或转移灶需要形成一定大小才能够被仪器成像和有效分辨；病理形态检查中，需要取到合适的检测标本，且有相当数量可观察到的肿瘤细胞存在。因此，无论是影像学诊断还是病理学诊断，都是肿瘤形成及转移后晚期、存在大量恶变细胞积累的阶段，如果在肿瘤发生转移的早期，能够发现并确定其转移，则可以指导临床治疗方案的设计，并提供有力的预后依据。血行播散是肿瘤转移的主要途径之一，所以在肿瘤患者外周血中进行肿瘤细胞基因表达、肿瘤特异性标记产物检测是了解肿瘤转移情况的一种有效方法，对肿瘤形成及转移的诊断具有极大的帮助，但是在肿瘤转移发生的早期，外周血中的肿瘤细胞一般很少，无法完全依赖病理形态检查，未形成转移灶或转移灶未达到一定体积时，影像学诊断也无能为力，因此，循环血中的微量肿瘤细胞基因表达和一些特异性产物检测的研究，引起了学者们的广泛关注。[0004] 循环肿瘤细胞中特异性基因mRNA 的定量测定，有利于肿瘤的早期诊断，治疗方案的确定以及预后的判断。随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测外周血中微量肿瘤细胞已成为可能并被尝试。[0005] 实时荧光定量PCR 技术，是指在PCR 反应体系中加入一对引物的同时加入一个特异性荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程。目前常用的TaqMan 荧光探针为寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，故检测不到荧光；在PCR 扩增过程中，Taq 酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。在PCR 扩增过程中，每个循环结束后检测一次荧光强度，整个反应结束后，便可得到一条工作曲线，根据该曲线可对未知模板进行定量分析。实时荧光定量PCR 技术是一种能够准确定量mRNA 的检测方法，通过检测肿瘤特异性基因mRNA 的表达以判断循环肿瘤细胞的存在。[0006] 乳腺癌特异性基因1(Breast cancer-specific gene 1,BCSG1) 是一种特异性的在乳腺癌中选择性表达的基因，其定位于人类染色体10q23，DNA 长度约5kb。BCSG1 基因编码合成1 条含127 个氨基酸的蛋白，其在乳腺癌组织中特异性表达，在正常乳腺或良性乳腺病变中几乎不表达，是一种与乳腺癌进展有关的肿瘤标记物。正常人外周血BCSG1 mRNA 呈阴性；游离于细胞外的mRNA 很不稳定，极易被RNA 酶解，故在外周血中若测得BCSG1 mRNA，则提示血循环中存在有完整的乳腺癌细胞。因此，BCSG1 mRNA 是一项较好的血源性乳腺癌细胞的监测指标。[0007] 检测乳腺癌患者骨髓及血中的BCSG1 mRNA对判断乳腺癌的发生、转移、复发，治疗效果评价及病情的动态观察具有重要意义，但目前尚没有合适的阳性率高的检测技术。发明内容[0008] 本发明的一个目的是提供一种用于检测人乳腺癌特异性基因1（BCSG1）mRNA 表达量的试剂盒，所述试剂盒中含有由序列表序列1 所示的一条引物和序列表序列2 所示的另一条引物组成的引物对。[0009] 所述试剂盒中还可含有核苷酸序列如序列表序列3 所示的探针，所述探针具体可为Taqman 探针。[0010] 所述试剂盒中还可含有尿嘧啶DNA 糖基化酶。[0011] 所述试剂盒中还可含有如下组成的PCR 反应缓冲液：由终浓度为17.9-19.5mmol/L 的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐、终浓度为2.55-2.90mmol/L 的氯化镁和终浓度为90.0-96.3mmol/L 的氯化钾组成，溶剂为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述PCR 反应缓冲液中的终浓度。[0012] 所述试剂盒中还可含有如下组成的PCR 反应液：由所述PCR 反应缓冲液、DNA 聚合酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、所述引物对、所述探针和尿嘧啶DNA 糖基化酶组成，其余为水。[0013] 所述PCR 反应缓冲液在所述PCR 反应液中的浓度具体可为0.9μl/μl ；[0014] 所述DNA 聚合酶在所述PCR 反应液中的浓度可为0.08-0.14U/μl，如0.08、0.1 或0.14U/μl ；[0015] 所述dATP 在所述PCR 反应液中的浓度可为370-420nmol/L，如370、400 或420nmol/L ；[0016] 所述dCTP 在所述PCR 反应液中的浓度可为370-420nmol/L，如370、400 或420nmol/L ；[0017] 所述dGTP 在所述PCR 反应液中的浓度可为370-420nmol/L，如370、400 或420nmol/L ；[0018] 所述dTTP 在所述PCR 反应液中的浓度可为180-215nmol/L，如180、200 或215nmol/L ；[0019] 所述dUTP 在所述PCR 反应液中的浓度可为370-420nmol/L，如370、400 或420nmol/L ；[0020] 每条所述引物在所述PCR 反应液中的浓度可为0.28-0.42μmol/L，如0.28、0.37或0.42μmol/L ；[0021] 所述探针在所述PCR 反应液中的浓度可为0.17-0.25μmol/L，如0.17、0.20 或0.25μmol/L ；[0022] 所述尿嘧啶DNA 糖基化酶在所述PCR 反应液中的浓度可为0.0U/μl，如0.7 或0.0180U/μl。[0023] 所述试剂盒中还可含有反转录缓冲液；所述反转录缓冲液由如下物质组成：终浓度为8.0-9.8μmol/L（如8.0、9.1 或9.8μmol/L）的Oligo(dT)12-18、终浓度为3.15-4.0U/μl（如3.15、3.6 或4.0U/μl）的RNA 酶抑制剂、终浓度为70.0-76.0mmol/L（如70.0、72.7 或76.0mmol/L）的二硫苏糖醇、终浓度为170-195mmol/L（170、182、或195mmol/L）的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐、终浓度为255-290mmol/L（如255、273 或290mmol/L）的氯化钾、终浓度为9.25-12.5mmol/L（如9.25、11 或12.5mmol/L）的氯化镁，其余为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述反转录缓冲液中的浓度。[0024] 所述试剂盒中还可含有反转录反应液；所述反转录反应液由所述反转录缓冲液、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、逆转录酶组成；其余为水；[0025] 所述反转录缓冲液在反转录反应液中的浓度具体可为0.786μl/μl ；[0026] 所述dATP 在反转录反应液中的浓度可为1.30-1.60mmol/L，如1.30、1.43 或1.60mmol/L ；[0027] 所述dCTP 在反转录反应液中的浓度可为1.30-1.60mmol/L，如1.30、1.43 或1.60mmol/L ；[0028] 所述dGTP 在反转录反应液中的浓度可为1.30-1.60mmol/L，如1.30、1.43 或1.60mmol/L ；[0029] 所述dTTP 在反转录反应液中的浓度可为1.30-1.60mmol/L，如1.30、1.43 或1.60mmol/L ；[0030] 所述逆转录酶在反转录反应液中的浓度可为11.5-16.5U/μl，如11.5、14.3 或16.5U/μl。[0031] 所述逆转录酶具体可为莫洛尼鼠白血病病毒（M-MLV）逆转录酶。[0032] 实验证明，临床确诊乳腺癌并已发生远端转移的病例用本发明试剂盒可以检出阳性（表1 结果）；临床上不能确诊是否已转移的乳腺癌病例用本发明方法也可检测出部分阳性（表2 结果）；临床上确诊应为阴性的，本发明试剂盒检测也为阴性（对照组结果），所以本发明试剂盒的准确性及特异性好，且比目前临床检验方法能更早地发现乳腺癌细胞的扩散，表明本发明的试剂盒可对BCSG1 mRNA 的表达进行准确的定性及定量分析，检测特异性高，可达100%。本发明试剂盒检测全血的灵敏度为100 拷贝/ml 全血。本发明的试剂盒可实时监测乳腺癌患者骨髓及血中的BCSG1 mRNA 表达量，对判断乳腺癌的发生、转移、复发，治疗效果评价及病情的动态观察具有重要意义，应用前景广阔。附图说明[0033] 图1 为标准品的荧光定量PCR 检测结果。[0034] 图2 为标准品的荧光定量PCR 检测的标准曲线。具体实施方式[0035] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0036] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0037] 下述实施例中，在利用实时荧光定量PCR 检测BCSG1 基因表达水平的同时，另单管检测样品中内参基因β-actin 的表达量，以确证RNA 样品及逆转录反应是否有问题，并可计算各样品中BCSG1 基因相对于β-actin 基因的表达水平。正常情况下，每毫升血液中β-actin 基因的表达量在107 拷贝以上，若β-actin 基因的表达量小于105 拷贝/ 毫升，则说明RNA 样品或逆转录反应存在问题，需重新取样进行RNA 样品的制备和 检测。[0038] β-actin 基因的引物对序列为：[0039] p1:5’-TTG CCG ACA GGA TGC AGA A-3’；[0040] p2:5’-GCC GAT CCA CAC GGA GTA CTT-3’；[0041] 探针序列为：5’-FAM-TCA TTG CTC CTC CTG AGC-TAMRA-3’；[0042] 扩增产物的长度为101bp。[0043] β-actin基因的使用详见发明人已发表文章：Min Cheng,Yongyan Chen,XiaoqinYu,Zhigang Tian and Haiming Wei.Diagnostic utility of LunX mRNA in peripheralblood and pleural fluid in patients with primary non-small cell lung cancer.BMCCancer.。[0044] 实施例1、定量检测人乳腺癌特异性基因1mRNA 表达水平的试剂盒[0045] 试剂盒的组成及其制备方法如下：[0046] 1、红细胞裂解液[0047] 溶剂为水，溶质及其在红细胞裂解液中的浓度分别为氯化铵1.52mol/L，碳酸氢钾0.1mol/L 和乙二胺四乙酸二钠0.01mol/L。红细胞裂解液在25℃条件下，pH 值为7.2。[0048] 2、无RNA 酶的水[0049] 向去离子水中加入焦碳酸二乙酯（DEPC，购自Biobasic 公司），至终浓度为0.05％（体积百分含量），22-25℃放置10-12 小时后，121℃高压灭菌20 分钟，22-25℃放置，备用。[0050] 3、RNA 提取液[0051] 为Trizol 试剂。[0052] 4、dNTP 混合物[0053] 含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，具体以其钠盐- 水溶液形式保存，25℃条件下，pH 值为7.0-7.5，四种dNTP 在混合物中的终浓度均为10mmol/L。[0054] 5、逆转录酶储存液[0055] 逆转录酶具体是M-MLV 逆转录酶，购自宝生物工程( 大连) 有限公司。[0056] 逆转录酶具体以其储存液形式保存，储存液由终浓度为20mmol/L 的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐、终浓度为100mmol/L 的氯化钠、终浓度为0.1mmol/L 的乙二胺四乙酸、终浓度为1.0mmol/L 的二硫苏糖醇、终浓度为50%（体积百分含量）的甘油、终浓度为0.01%（体积百分含量）的Nonidet p-40组成，溶剂是水；逆转录酶在储存液中的终浓度为200U/μl。[0057] 逆转录酶在25℃条件下，pH 值为7.5。[0058] 6、反转录缓冲液[0059] 由终浓度为9.1μmol/L 的Oligo(dT)12-18、终浓度为3.6U/μl 的RNA 酶抑制剂、终浓度为72.7mmol/L 的二硫苏糖醇、终浓度为182mmol/L 的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐、终浓度为273mmol/L 的氯化钾、终浓度为11mmol/L 的氯化镁组成，其余为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述反转录缓冲液中的浓度。[0060] 反转录缓冲液在25℃条件下，pH 值为8.3。[0061] 7、反转录反应液[0062] 反转录反应液由反转录缓冲液、dNTP、逆转录酶组成。具体可以是将上述反转录缓冲液、dNTP 混合物和逆转录酶储存液按比例混合而成。[0063] 所述反转录缓冲液在反转录反应液中的浓度为0.786μl/μl ；[0064] 所述dATP 在反转录反应液中的浓度为1.43mmol/L ；[0065] 所述dCTP 在反转录反应液中的浓度为1.43mmol/L ；[0066] 所述dGTP 在反转录反应液中的浓度为1.43mmol/L ；[0067] 所述dTTP 在反转录反应液中的浓度为1.43mmol/L ；[0068] 所述逆转录酶在反转录反应液中的浓度为14.3U/μl。[0069] 8、引物对[0070] P1( 上游引物) ：5’-GGGTGAGGCATCCAAAGAGA-3’（序列表序列1 所示）；[0071] P2( 下游引物) ：5’-TGGGCAGCCGCATGTC-3’（序列表序列2 所示）。[0072] 引物可溶于TE 溶液中（TE 溶液的组成为：10mmol/L 三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐，1mmol/L 乙二胺四乙酸和水），引物浓度为5μmol/L。[0073] 9、探针[0074] 5’-FAM-AGAGGAAGTGGCAGAGGAGGCCCA-TAMRA-3’（序列表序列3 所示）。[0075] 探针可溶于TE 溶液中（TE 溶液的组成为10mmol/L 三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐、1mmol/L 乙二胺四乙酸和水），探针的浓度为2μmol/L。[0076] 上述引物和探针是以BCSG1 全长cDNA 序列（GenBank 登录号为：NM）为模板，使用ABI7000 型实时荧光定量PCR 仪随机软件分析TaqMan 引物和探针位点，同时考虑BCSG1 基因组DNA 序列情况，从中选择最佳组合得到的。上述引物和探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。[0077] 10、PCR 反应缓冲液[0078] 由终浓度为18.5mmol/L 的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐、终浓度为2.78mmol/L 的氯化镁和终浓度为92.6mmol/L 的氯化钾组成，溶剂为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述PCR 反应缓冲液中的终浓度。[0079] 11、PCR 反应液[0080] 由所述PCR 反应缓冲液、Taq 酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、引物对、探针和尿嘧啶DNA糖基化酶组成，其余为水；[0081] 所述PCR 反应缓冲液在所述PCR 反应液中的浓度为0.9μl/μl ；[0082] 所述Taq 酶在所述PCR 反应液中的浓度为0.1U/μl ；[0083] 所述dATP 在所述PCR 反应液中的浓度为400nmol/L ；[0084] 所述dCTP 在所述PCR 反应液中的浓度为400nmol/L ；[0085] 所述dGTP 在所述PCR 反应液中的浓度为400nmol/L ；[0086] 所述dTTP 在所述PCR 反应液中的浓度为200nmol/L ；[0087] 所述dUTP 在所述PCR 反应液中的浓度为400nmol/L ；[0088] 每条所述引物在所述PCR 反应液中的浓度为0.37μmol/L ；[0089] 所述探针在所述PCR 反应液中的浓度为0.20μmol/L ；[0090] 所述UNG 酶在所述PCR 反应液中的浓度为0.0167U/μl。[0091] PCR 反应液在25℃条件下，pH 值为8.3。[0092] 12、尿嘧啶DNA 糖基化酶（UNG 酶）储存液[0093] UNG 酶以储存液形式保存；[0094] UNG 酶储存液由终浓度为50％（体积百分含量）的甘油、由终浓度为30mmol/L 的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐、由终浓度为150mmol/L 的氯化钠、由终浓度为1.0mmol/L 的乙二胺四乙酸、由终浓度为1.0mmol/L 的二硫苏糖醇、由终浓度为0.05％（体积百分含量）的Tween20、由终浓度为1U/μl 的尿嘧啶DNA 糖基化酶组成；溶剂是水；各物质的浓度均是其在尿嘧啶DNA 糖基化酶（UNG 酶）储存液中的终浓度。[0095] UNG 酶储存液在25℃条件下，pH 值为7.5。[0096] 12、标准品[0097] 标准品为终浓度为2×107 拷贝数/μl 的pMD18-BCSG1-166 重组质粒，TE 溶液溶解（TE 溶液的组成为10mmol/L 三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐,1mmol/L 乙二胺四乙酸, 水）。[0098] pMD18-BCSG1-166 重组质粒中插入的BCSG1 片段（名称为BCSG1-166) 的DNA 序列如序列表序列4 所示。[0099] pMD18-BCSG1-166 重组质粒的构建方法如下：[0100] 1、细胞总RNA 的提取[0101] 1）将人乳腺癌细胞SK-BR-3，用DMEM 完全培养基（Gibco 公司）按常规方法进行培养。[0102] 2）将培养的细胞用0.25％胰蛋白酶（质量百分含量）消化，1000rpm 离心收集细胞，转移到1.5mL 离心管中，每管1×106 个细胞。[0103] 3）提取细胞总RNA，具体过程如下：[0104] ① . 向细胞沉淀中加入1.0ml RNA 提取液，上下颠倒使细胞完全裂解，并将溶液转移至1.5ml 无RNA 离心管中。[0105] ② . 加入200μl 氯仿，剧烈摇动15 秒，冰上放置3 分钟。[0106] ③ .4℃，12000g，离心15 分钟。吸取上清液至新的无RNA 酶离心管中，注意不要吸取到中间层，每管加入500μl 异丙醇，反复颠倒3 ～ 5 次，冰上放置10 分钟。[0107] ④ .4℃，12000g，离心10 分钟。[0108] ⑤ . 弃Ep 管中的液体，加入75% 乙醇1ml，颠倒2 ～ 3 次。4℃，7500g，离心5 分钟。重复洗涤一次。[0109] ⑥ . 弃管中液体，使用离心机短暂离心收集，吸尽管中液体，室温下倒置5 分钟，乙醇挥发之后，加入50μl 的无RNA 酶的水，溶解RNA，轻弹管底，促进溶解，室温溶解3 分钟，冰上放置，备用。[0110] 2、逆转录反应[0111] 反转录体系为：反转录反应液3.5μl、总RNA 溶液4.0μl、无RNA 酶的水2.5μl。[0112] 反转录反应条件为：37℃，20 分钟→ 95℃，5 分钟。[0113] 反应结束后，取出离心管置于冰盒上。[0114] 3、PCR 扩增[0115] 用TaKaRa 公司的普通PCR 扩增试剂盒，参照试剂盒说明书进行操作。[0116] PCR 反应体系为：反转录产物5μl、10×PCR 缓冲液5.0μl、dNTP 混合物4.0μl、上、下游引物（P1、P2）各2.0μl、Taq 酶0.5μl、水31.5μl。[0117] PCR 反应条件为：先94℃、3 分钟→再94℃、30 秒，60℃、45 秒，72℃、50 秒，共35 个循环→最后72℃、7 分钟。[0118] 4、BCSG1-166 扩增产物的获得[0119] 1）将PCR 扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切取含166bp 目的DNA片段的琼脂糖凝胶，用纸巾擦干后，切碎，称重，按照100mg=100μl 的比例确定胶的体积。[0120] 2）用DNA 凝胶回收试剂盒（购自上海英俊生物技术有限公司）回收扩增产物[0121] ① . 按照试剂盒说明书中的比例在回收胶中加入DE-A 液，60℃加热至完全熔化。[0122] ② . 加入0.5倍体积于DE-A液的DE-B液，混匀；加入异丙醇，使其终浓度为20％。[0123] ③ . 将上述液体转入制备管中，5500rpm 离心1 分钟，弃滤液。[0124] ④ . 加入0.5mL 缓冲液W1 后，5500rpm 离心1 分钟，弃滤液。[0125] ⑤ . 加入0.7mL 缓冲液W2，5500rpm 离心1 分钟，弃滤液。[0126] ⑥ . 再加入0.7mL 缓冲液W2，5500rpm 离心1 分钟，弃滤液；12000rpm，离心1 分钟，以甩干滤膜基质。[0127] ⑦ . 将制备管置于新的1.5mL 离心管中，在滤膜中央加入25μl 水，室温静置1 分钟后，12000rpm，离心1 分钟洗脱DNA。得到纯化后的PCR 扩增产物。[0128] 5、BCSG1-166 的克隆及鉴定[0129] 1）重组载体的构建[0130] ① .10μl 体系中，加入1μl T 载体（pMD18-T Vector）（TaKaRa），4μl 步骤4 纯化后的PCR 扩增产物，加入5μl 连接缓冲液（100mmol/L 三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐、15mmol/L 氯化镁、1.0mmol/L 三磷酸腺苷、20mmol/L 二硫苏糖醇（Invitrogen）、1U/μlDNA 连接酶。连接缓冲液在25℃条件下，pH 值为7.5。），16℃反应14 小时。[0131] ② . 取5μl 连接产物，加入到100μl 大肠杆菌DH5α 感受态细菌中，混匀后冰浴40 分钟，置于42℃水中热休克90 秒；冰浴，2 分钟。[0132] ③ . 加入无抗生素的LB 培养基400μl，于37℃摇床上以150rpm 的速度混合振摇45 分钟后，将离心管中液体均匀地涂布于LA 平板上，37℃平放20 分钟后，倒置培养12 小时。[0133] 2）重组载体的鉴定[0134] ① . 观察LA 平板上的菌落，随机挑取长得较好的菌落，分别转至装有5mL LA 培养基的大试管中，编号后置37℃摇床中，250rpm，振摇8-14 小时左右，至OD600 ≈ 0.4。[0135] ② . 取1.5mL 培养物至离心管中，4℃，11000rpm 离心30 秒，弃尽上清液。[0136] ③ .100μl 预冷的裂解液Ⅰ（500mmol/L 葡萄糖,25mmol/L Tris·Cl(pH8.0，25℃ ),10mmol/L EDTA(pH8.0，25℃ )，水）重悬沉淀，剧烈振荡混匀后加入200μl 新配制的裂解液Ⅱ（200mmol/l NaOH，1%SDS，水），混匀后，冰浴3 分钟，再加入150μl 预冷的裂解液Ⅲ（3mol/L 醋酸钾；pH5.2，25℃），颠倒混匀后冰浴3-5 分钟；4℃，11000rpm 离心5 分钟后将上清转移至另一离心管中。[0137] ④ . 加入等体积的酚/ 氯仿(1:1)，振荡后4℃，11000rpm 离心2 分钟，再将上清转移至另一离心管。[0138] ⑤ . 加入1/10 体积的3M NaAc 溶液和2.5 倍无水乙醇，混匀后，室温静置10 分钟，4℃，11000rpm 离心10 分钟后弃上清。[0139] ⑥ . 加入1mL70％乙醇，振荡漂洗后4℃，11000rpm 离心2 分钟；弃去上层液体。[0140] ⑦ . 加入少量无水乙醇，4℃，11000rpm 离心2 分钟，弃去乙醇后，室温倒置10 分钟，加入30μl 蒸馏水溶解质粒DNA。[0141] ⑧ . 取适量的质粒DNA 作为模板，在引物P1 和P2 的引导下，进行PCR 鉴定，可扩增出166bp DNA 片段的为阳性克隆质粒，从而筛选出目的菌落。[0142] 3）BCSG1-166 扩增产物的鉴定[0143] ① . 质粒的大量抽提[0144] A）取1mL 含目的菌落的菌液，加入到30mL LA 培养基中，摇床培养至OD600 约为0.6。[0145] B）取25mL 上述菌液接种至300mL LA 培养基中，37℃，250rpm 培养10-14 小时，然后4℃，4500rpm，20 分钟离心收菌。[0146] C）用200mL 预冷的STE（10mmol/L Tris-HCl(PH8.0，25 ℃ )，0.1mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(PH8.0，25℃ )，水）重悬菌体，4℃，4500rpm，20 分钟离心收菌。[0147] D） 加入9mL Solution Ⅰ（500mmol/L 葡萄糖,25mmol/L Tris·Cl(pH8.0，25℃ ),10mmol/L EDTA(pH8.0，25℃ )，水），混匀，再加入1mL 用10mmol/L Tris-HCl（pH8.0）新鲜配制的溶菌酶（10mg/mL），再加入10mL 新鲜配制的Solution Ⅱ（200mmol/l NaOH，1%SDS，水），轻轻混匀5-7 次，室温静置5 分钟。[0148] E）加入7.5mL 冰冷的Solution Ⅲ（3mol/L 醋酸钾；pH5.2，25℃），轻轻混匀，冰浴10 分钟；4℃，11000rpm 离心10 分钟，取上清。[0149] F）加入2/3 体积的异丙醇，混匀，室温静置10 分钟，11000rpm 离心10 分钟，弃上清。[0150] G）用70％乙醇洗涤沉淀，8000rpm，15 分钟离心回收，用2mL TE 溶解沉淀。[0151] H）加入2mL5mol/L 的LiCl，混匀，10000g 离心10 分钟，弃去上清。[0152] I）用70％乙醇洗涤沉淀，弃上清，尽量控干液体，室温静置至干燥。[0153] J）加入300μl TER，溶解沉淀，转移至1.5mL 离心管中，37℃水浴1-2 小时。[0154] K）加入300μl 1.6mol/L NaCl( 含13％聚乙二醇)，混匀，4℃，12000rpm 离心15分钟，弃上清。[0155] L）250μl TE（pH8.0）溶解沉淀，分别用酚、酚/ 氯仿、氯仿各抽提一次。[0156] M）取上清，加入60μl 10mol/L NH4Ac 及2 倍体积的无水乙醇（或95％乙醇），混匀，4℃，12000g 离心5 分钟，弃上清。[0157] N）120μl75％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000g 离心10 分钟，弃上清，尽量控干液体，室温静置至干燥。[0158] O）加入100μl 三蒸水溶解沉淀，紫外分光光度计下检测质粒的浓度和纯度。[0159] ② . 质粒的序列测定[0160] 对含有目的基因片段的阳性克隆质粒用美国Applied Biosystems 公司的377 测序仪进行序列测定，结果重组载体中的插入片段BCSG1-166 具有序列表序列4 的DNA 序列，将该重组载体命名为pMD18-BCSG1-166。将pMD18-BCSG1-166 作为标准品。[0161] ③将上述抽提得到的质粒pMD18-BCSG1-166 用TE 溶液溶解（TE 溶液的组成为10mmol/L 三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐，1mmol/L 乙二胺四乙酸, 水）至终浓度为2×107 拷贝数/μl。[0162] 13、质控品[0163] 阳性质控品为含有BCSG1mRNA 的总RNA，其制备方法与标准品制备中提取人乳腺癌细胞SK-BR-3 总RNA 的方法相同；[0164] 阴性质控品为正常人外周血总RNA ：取离体的正常人的外周血，分离有核细胞，按照标准品制备中提取人乳腺癌细胞SK-BR-3 总RNA 的方法进行制备；[0165] 将提取到得两种总RNA 分别用无RNA 酶的水溶解至终浓度为0.2μg/μl，取5μlRNA 样品加入1ml 无水乙醇中，-20℃保存。[0166] 本发明试剂盒中还可包括PCR 管（购于美国Applied Biosystems(ABI) 公司）等。[0167] 将上述各组分分装，组合为10 人份的试剂盒，每盒中各组分的量为：PCR 管、红细胞裂解液1 瓶（20mL/ 瓶）、无RNA 酶水1 瓶（8mL/ 瓶）、RNA 提取液1 瓶（10mL/ 瓶）、dNTP 混合物1 管（6.0μl/ 管）、逆转录酶储存液1 管（3.0μl/ 管）、反转录缓冲液1 管（33μl/ 管）、PCR 反应缓冲液1 管（251.75μl/ 管）、UNG 酶储存液1 管（4.75μl/ 管）、引物对和探针1管（28.5μl/ 管）、标准品1 管（10μl/ 管）、阳性质控品1 管（1.0μg/ 管）、阴性质控品1 管（1.0μg/ 管）。[0168] 实施例2、乳腺癌特异性基因1mRNA 表达量的检测[0169] 用实施例1 制备的试剂盒检测下述实验组和对照组标本中的乳腺癌特异性基因1mRNA 表达量。[0170] 实验组：33 例病理诊断确诊的乳腺癌患者，其中12 例临床确诊已发生转移。[0171] 对照组：15 例乳腺良性疾病患者，10 例健康人。[0172] 一、实验准备[0173] 1、将红细胞裂解液按1:9 的比例用灭菌去离子水稀释成红细胞裂解液稀释液。[0174] 2、配制75％的乙醇溶液25mL。[0175] 二、取样[0176] 取离体的新鲜的受试者静脉血3mL 于无菌离心管中，使用EDTA 作抗凝剂（1.44mg/mL 全血）。样本采集后应立即使用，若不能立即使用，可在4℃保存1-2 小时，但时间不宜过长，否则将影响测定结果。全血经处理后，得到的有核细胞使用RNA 提取液裂解后，可于-20℃或-80℃中保存。得到实验组样品和对照组样品。[0177] 三、实验组样品和对照组样品的细胞总RNA 的提取[0178] 1）在50ml 无菌离心管中，加入3ml 新鲜抗凝血液及9ml 的红细胞裂解液稀释液，漩涡振荡混匀。[0179] 2）冰浴10 分钟，在漩涡振荡器上迅速混匀两次，4℃，1500rpm，离心5 分钟沉淀有核细胞，完全弃去含有裂解红细胞的上清液。[0180] 3）用6ml 的红细胞裂解液稀释液洗涤沉淀的有核细胞，漩涡振荡以完全悬浮细胞，4℃，1500rpm，离心5 分钟，并再次完全弃去上清液。[0181] 4）用1ml 的红细胞裂解液稀释液重悬沉淀的有核细胞，转到无RNA 酶的1.5ml 离心管中，4℃，3000rpm，离心3 分钟，弃尽上清液。[0182] 5）向细胞沉淀中加入1.0ml RNA提取液，上下颠倒使细胞完全裂解，并将溶液转移至1.5ml 无RNA 离心管中。[0183] 6）加入200μl 氯仿，剧烈摇动15 秒，冰上放置3 分钟。[℃，12000g，离心15 分钟。吸取上清液至新的无RNA 酶离心管中，注意不要吸取到中间层，每管加入500μl 异丙醇，反复颠倒3-5 次，冰上放置10 分钟。[℃，12000g，离心10 分钟。[0186] 9）弃Ep 管中的液体，加入75% 乙醇1ml，颠倒2-3 次。4℃，7500g，离心5 分钟。重复洗涤一次。[0187] 10）弃管中液体，使用离心机短暂离心收集，吸尽管中液体，室温下倒置5 分钟，乙醇挥发之后，加入50μl 的无RNA 酶的水，溶解RNA，轻弹管底，促进溶解，室温溶解3 分钟，冰上放置，备用。得到实验组样品RNA 和对照组样品RNA。[0188] 四、荧光定量PCR[0189] 1、实验组样品RNA、对照组样品RNA、阳性对照和阴性对照的反转录反应[0190] 反转录体系：反转录反应液3.5μl、总RNA 溶液5.0μl、无RNA 酶的水1.5μl。[0191] 反转录反应条件为：37℃，20 分钟→ 95℃，5 分钟。[0192] 反应结束后，将反应产物取出置于冰盒上。得到实验组样品反转录产物、对照组样品反转录产物、阳性质控品反转录产物和阴性质控品反转录产物。[0193] 2、标准品的处理[0194] 将标准品(2×107 拷贝数/μl) 梯度稀释为2×106，2×105，2×104，2×103，2×102，2×101 拷贝数/μl。[0195] 3、荧光定量PCR[0196] 在ABI 公司7000 型定量PCR 仪上进行PCR 扩增。[0197] PCR 反应体系为：模板5.0μl、PCR 反应液15.0μl、水5.0μl。[0198] 其中，模板分别为实验组样品反转录产物、对照组样品反转录产物、阳性质控品反转录产物、阴性质控品反转录产物和标准品。[0199] PCR 反应条件为：37℃，10 分钟→ 95℃，15 分钟→（95℃，15 秒→ 60℃，1 分钟）。括号内条件共重复45 个循环。[0200] 五、标准曲线的制作[0201] 标准品荧光定量PCR 检测结果如图1 所示。横坐标为PCR 反应的循环数，纵坐标为检测器检测到的荧光值，图中曲线从左至右分别代表起始模板数为：1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102 拷贝数。[0202] 根据检测结果绘制标准曲线，标准曲线如图2 所示。横坐标为X，代表标准品起始拷贝数的对数值（Log10），纵坐标为Y，代表Ct 值。标准曲线的相关系数为0.9925，方程为Y=-3.356X+44.37。[0203] 六、检测结果[0204] 选中上述所有样品检测孔，根据标准曲线进行相应分析，得出待测样品的起始模板数（M）。每毫升全血样本中BCSG1 mRNA 的拷贝数N=M×6.6。[0205] 每毫升全血样本中BCSG1 mRNA 的拷贝数大于等于100 时，确定为患病阳性。[0206] 具体结果如下：[ 例临床确诊已转移的乳腺癌患者检测结果均为阳性，具体结果如表1 所示。[0208] 表1、临床确诊已转移的乳腺癌患者BCSG1 mRNA 拷贝数的检测结果[0209]编号 性别 年龄 标本 BCSG1 mRNA（拷贝数/ 毫升全血）1 女 53 外周血 2.25×1052 女 56 外周血 9.83×1053 女 59 外周血 2.09×1054 女 40 外周血 2.54×1045 女 46 外周血 2.97×1036 女 45 外周血 5.84×1057 女 45 外周血 2.40×1048 女 36 外周血 3.29×1069 女 57 外周血 1.13×10410 女 66 外周血 3.61×10511 女 42 外周血 1.09×10412 女 68 外周血 9.94×105[ 例临床未确诊转移的乳腺癌患者中12 例为阳性，其余9 例为阴性。阳性结果如表2 所示。[0211] 表2、临床未确诊转移的乳腺癌患者BCSG1 mRNA 拷贝数的阳性检测结果[0212]编号 性别 年龄 标本 BCSG1 mRNA（拷贝数/ 毫升全血）14 女 40 外周血 1.33×10416 女 39 外周血 2.22×10317 女 52 外周血 9.27×10319 女 71 外周血 7.09×10221 女 39 外周血 7.65×10422 女 72 外周血 1.26×10523 女 38 外周血 2.76×10426 女 55 外周血 8.81×10429 女 51 外周血 2.60×10430 女 47 外周血 7.53×10332 女 57 外周血 4.65×10233 女 48 外周血 4.84×104[0214] 3）对照组：15 例乳腺良性疾病患者、10 例正常健康人均为阴性，未检测到BCSG1mRNA 的表达。[0215] 上述实验结果表明，临床确诊乳腺癌并已发生远端转移的病例用本发明方法可以检出阳性（表1 结果）；临床上不能确诊是否已转移的乳腺癌病例用本发明方法也可检测出部分阳性（表2 结果）；临床上确诊应为阴性的，本发明方法检测也为阴性（对照组结果），所以本发明方法检测的准确性及特异性好，且比目前临床检验方法更早的发现乳腺癌细胞的扩散，表明本发明的试剂盒可对BCSG1 mRNA 的表达进行准确的定性及定量分析，检测特异性高，可达100%。[0216] 七、本发明检测方法灵敏度的鉴定[0217] 将已确定BCSG1 mRNA 含量的离体的人外周血样品进行倍比（10 倍）稀释，按照实施例2 中所述方法进行操作，分离有核细胞、提取细胞总RNA，并进行RT-PCR 操作。实验结果表明，本发明试剂盒对BCSG1 mRNA 的检测灵敏度为≥ 100 拷贝/ml 全血。即当样品中BCSG1 mRNA 的浓度≥ 100 拷贝/ml 全血时，本发明方法即可检出，灵敏度高。[0218] 实施例3、试剂盒及其应用[0219] 一、试剂盒组成及制备方法[0220] 与实施例1 中所述相同，不同的如下：[0221] 1、PCR 反应缓冲液：由终浓度为17.9mmol/L 的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐、终浓度为2.55mmol/L 的氯化镁和终浓度为90.0mmol/L 的氯化钾组成，溶剂为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述PCR 反应缓冲液中的终浓度。[0222] 2、PCR 反应液：由所述PCR 反应缓冲液、Taq 酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、尿嘧啶DNA 糖基化酶（UNG 酶）和实施例1 的引物对和探针组成，其余为水；[0223] 所述PCR 反应缓冲液在所述PCR 反应液中的浓度为0.9μl/μl ；[0224] 所述Taq 酶在所述PCR 反应液中的浓度为0.08U/μl ；[0225] 所述dATP 在所述PCR 反应液中的浓度为370nmol/L ；[0226] 所述dCTP 在所述PCR 反应液中的浓度为370nmol/L ；[0227] 所述dGTP 在所述PCR 反应液中的浓度为370nmol/L ；[0228] 所述dTTP 在所述PCR 反应液中的浓度为180nmol/L ；[0229] 所述dUTP 在所述PCR 反应液中的浓度为370nmol/L ；[0230] 每条所述引物在所述PCR 反应液中的浓度为0.28μmol/L ；[0231] 所述探针在所述PCR 反应液中的浓度为0.17μmol/L ；[0232] 所述UNG 酶在所述PCR 反应液中的浓度为0.0150U/μl。[0233] 3、反转录缓冲液；所述反转录缓冲液由如下物质组成：终浓度为8.0μmol/L 的Oligo(dT)12-18、终浓度为3.15U/μl 的RNA 酶抑制剂、终浓度为70.0mmol/L 的二硫苏糖醇、终浓度为170mmol/L 的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐、终浓度为255mmol/L 的氯化钾、终浓度为9.25mmol/L 的氯化镁，其余为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述反转录缓冲液中的浓度。[0234] 4、反转录反应液：由所述反转录缓冲液、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、逆转录酶组成；其余为水；[0235] 所述反转录缓冲液在反转录反应液中的浓度为0.786μl/μl ；[0236] 所述dATP 在反转录反应液中的浓度为1.30mmol/L ；[0237] 所述dCTP 在反转录反应液中的浓度为1.30mmol/L ；[0238] 所述dGTP 在反转录反应液中的浓度为1.30mmol/L ；[0239] 所述dTTP 在反转录反应液中的浓度为1.30mmol/L ；[0240] 所述逆转录酶在反转录反应液中的浓度为11.5U/μl。[0241] 二、用试剂盒对人外周血进行检测[0242] 实验方法与实施例2 中所述相同，不同的是：所用的PCR 反应缓冲液、PCR 反应液、反转录缓冲液和反转录反应液为本实施例步骤一所述。[0243] 实验设3 次重复，结果与实施例2 中所述结果无显著差异，特异性100%，灵敏度为≥ 100 拷贝/ml 全血。[0244] 实施例4、试剂盒及其应用[0245] 一、试剂盒组成及制备方法[0246] 与实施例1 中所述相同，不同的如下：[0247] 1、PCR 反应缓冲液：由终浓度为19.5mmol/L 的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐、终浓度为2.90mmol/L 的氯化镁和终浓度为96.3mmol/L 的氯化钾组成，溶剂为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述PCR 反应缓冲液中的终浓度。[0248] 2、PCR 反应液：由所述PCR 反应缓冲液、Taq 酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、尿嘧啶DNA 糖基化酶（UNG 酶）和实施例1 的引物对和探针组成，其余为水；[0249] 所述PCR 反应缓冲液在所述PCR 反应液中的浓度为0.9μl/μl ；[0250] 所述Taq 酶在所述PCR 反应液中的浓度为0.14U/μl ；[0251] 所述dATP 在所述PCR 反应液中的浓度为420nmol/L ；[0252] 所述dCTP 在所述PCR 反应液中的浓度为420nmol/L ；[0253] 所述dGTP 在所述PCR 反应液中的浓度为420nmol/L ；[0254] 所述dTTP 在所述PCR 反应液中的浓度为215nmol/L ；[0255] 所述dUTP 在所述PCR 反应液中的浓度为420nmol/L ；[0256] 每条所述引物在所述PCR 反应液中的浓度为0.42μmol/L ；[0257] 所述探针在所述PCR 反应液中的浓度为0.25μmol/L ；[0258] 所述UNG 酶在所述PCR 反应液中的浓度为0.018U/μl。[0259] 3、反转录缓冲液；所述反转录缓冲液由如下物质组成：终浓度为9.8μmol/L 的Oligo(dT)12-18、终浓度为4.0U/μl 的RNA 酶抑制剂、终浓度为76.0mmol/L 的二硫苏糖醇、终浓度为195mmol/L 的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐、终浓度为290mmol/L 的氯化钾、终浓度为12.5mmol/L 的氯化镁，其余为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述反转录缓冲液中的浓度。[0260] 4、反转录反应液：由所述反转录缓冲液、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、逆转录酶组成；其余为水；[0261] 所述反转录缓冲液在反转录反应液中的浓度为0.786μl/μl ；[0262] 所述dATP 在反转录反应液中的浓度为1.60mmol/L ；[0263] 所述dCTP 在反转录反应液中的浓度为1.60mmol/L ；[0264] 所述dGTP 在反转录反应液中的浓度为1.60mmol/L ；[0265] 所述dTTP 在反转录反应液中的浓度为1.60mmol/L ；[0266] 所述逆转录酶在反转录反应液中的浓度为16.5U/μl。[0267] 二、用试剂盒对人外周血进行检测[0268] 实验方法与实施例2 中所述相同，不同的是：所用的PCR 反应缓冲液、PCR 反应液、反转录缓冲液和反转录反应液为本实施例步骤一中所述。[0269] 实验设3 次重复，结果与实施例2 中所述结果无显著差异，特异性100%，灵敏度为≥ 100 拷贝/ml 全血。[0001]CN
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发明人：程民 胡世莲 魏海明 沈国栋陈永艳 徐维平 徐婷娟 王卫东
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